Characterization of the complex of antimicrobial peptide tachyplesin and C1q protein

Abstract

АННОТАЦИЯ Выпускной квалификационной работы обучающегося по основной образовательной программе бакалавриата Пашинской Любови Дмитриевны Основная образовательная программа «Биология» Направление подготовки: «Биология» Научный руководитель – доцент кафедры биохимии, к.б.н. Берлов Михаил Николаевич «Изучение взаимодействия белка С1q каскада комплемента с антимикробным пептидом тахиплезином-1» Аннотация: Одной из основных систем врождённого иммунитета является система комплемента, представляющая собой сеть белков плазмы крови и мембранных белков, активирующих друг друга в результате реакций ограниченного протеолиза. Компоненты комплемента участвуют в воспалительной реакции, фагоцитозе апоптотических клеток, опсонизации и лизисе микроорганизмов. Наличие патофизиологических процессов, связанных с избыточной или недостаточной активацией каскада комплемента, является предпосылкой для поиска агентов, способных модулировать активацию комплемента. В качестве регуляторов активации комплемента могут выступать антимикробные пептиды (АМП), для которых характерно доминирование β-структуры, стабилизированной дисульфидными связями. Для разработки лекарственных препаратов на основе АМП изучение взаимодействия β-структурных АМП с паттерн-распознающими молекулами системы комплемента, инициирующими её активацию, представляется первостепенной задачей. В качестве модели такого взаимодействия был получен комплекс паттерн-распознающей молекулы классического пути активации комплемента С1q и β-шпилечного АМП тахиплезина-1 из мечехвоста Tachypleus tridentatus. Целью данной работы было изучение взаимодействия паттерн-распознающей молекулы классического пути каскада комплемента С1q с антимикробным пептидом тахиплезином-1 in vitro. Белок С1q выделили из сыворотки крови здоровых доноров двумя различными способами: было показано, что метод, сочетающий осаждение С1q из сыворотки полиэтиленгликолем 3350 с аффинной и ионообменной хроматографиями, более эффективен, чем метод, включающий осаждение С1q из сыворотки при уменьшении её ионной силы на первом этапе. Оценку стехиометрии связывания тахиплезина-1 (ТР-1) с С1q проводили методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии. При титровании пробы, содержащей С1q (2,23 мг/мл), раствором ТР-1 (4,53 мг/мл) получили нерастворимый преципитат комплекса ТР-1 и С1q. Соотношение ТР-1/С1q в преципитате исследовали также методом последовательных разведений в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии SDS. Было установлено, что соотношение по количеству молекул в полученном преципитате комплекса ТР-1/С1q составило примерно 200 : 1. Данные, полученные методами ЯМР-спектроскопии и электрофореза, хорошо согласуются.

ANNOTATION of Bachelor’s thesis accomplished by student of basic educational program of baccalaureate Lyubov Pashinskaya Specialization: «Biology» Scientific supervisor – Candidate of Biology M.N. Berlov «Characterization of The Complex between Antimicrobial Peptide Tachyplesin-1 and C1q Protein» Annotation: The complement system is a key component of innate immunity. It is organized as a network of soluble and membrane-associated proteins. Complement activation leads to a cascade of proteolytic reactions and results in opsonization and phagocytosis of pathogens, cell lysis and inflammation. Inappropriate complement activation and complement deficiencies are the underlying cause of the pathophysiology of many diseases. Therefore, there is need for therapeutic agents capable of modulating complement activation. β-structural antimicrobial peptides (AMP) stabilized by one or several disulfide bonds can modulate complement activation. One of the first steps for development of new drugs based on AMP can be studying the interaction between β-structural AMP and pattern recognition molecules of the complement system. As a model of such an interaction, we have introduced a complex between β-structural AMP tachyplesin-1 and C1q protein, which activates complement through the classical pathway. The purpose of this research is to study the interaction between pattern recognition molecule of the classical pathway of the complement cascade and antimicrobial peptide tachyplesin-1 in vitro. C1q was purified from serum of healthy donors using 2 different methods. Our research demonstrated that the method which combines precipitation of C1q from serum by adding polyethylene glycol 3350 with affinity and ion-exchange chromatography is more effective than the method including precipitation of C1q from serum in low ionic strength conditions as a first step. We estimated the stoichiometry of the interaction between tachyplesin-1 (TP-1) and C1q applying the method of proton NMR-spectroscopy in solution. As we titrated the sample containing C1q (2,23 mg/ml) with TP-1 solution (4,53 mg/ml) we observed irreversible precipitation of the complex between C1q and TP-1. The ratio of TP-1/C1q in the precipitate was estimated using the method of sequential dilutions and denaturing electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of SDS. It was shown that the precipitate contained TP-1 and C1q molecules in a ratio of 200 : 1. Experimental data, obtained from electrophoresis correlate with the data obtained from NMR-spectroscopy.