Role of exosomes and microvesicles in extracellular proteasome transport by human cancer cells

Abstract

Убиквитин-протеасомная система осуществляет большую часть регулируемого внутриклеточного протеолиза. В недавних исследованиях протеасомы обнаружены не только внутри клеток, но и во внеклеточном пространстве, причём концентрация внеклеточных протеасом является важным прогностическим признаком развития многих заболеваний. Механизм транспорта внеклеточных протеасом остаётся неизвестным. Согласно литературным данным субъединицы протеасом и даже функционально активные протеасомы были обнаружены во внеклеточных везикулах. Существует несколько типов внеклеточных везикул: экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца. Апоптотические тельца представляют собой «останки» клеток, погибших в результате апоптоза. Микровезикулы образуются путем выпячивания участка плазматической мембраны и отпочкования его в окружающую среду. Экзосомы формируются в мультивезикулярных тельцах, которые затем сливаются с клеточной мембраной и выбрасывают экзосомы во внеклеточную среду. Проведя несколько этапов центрифугирования, мы разделили среду, кондиционированную клетками человека линий K562 и RPMI-8226, на несколько фракций. Протеасомные субъединицы не были обнаружены во фракции микровезикул, их незначительное количество было показано в составе экзосом клеток К562. Аналогичные результаты были получены для клеток RPMI-8226 с той лишь разницей, что незначительное количество протеасомных субъединиц было также идентифицировано во фракции микровезикул. Однако основной пул внеклеточных протеасом был обнаружен в истощенной везикулами фракции кондиционированной клетками среды. Чтобы исключить возможное высвобождение протеасом из экзосом или микровезикул в результате повреждения их в процессе центрифугирования, мы использовали ингибиторы везикулярного транспорта диметиламилорид и блеббистатин. Присутствие данных ингибиторов везикулярного транспорта в среде культивирования клеток не оказывало влияния на количество внеклеточных протеасом. В соответствии с полученными данными можно утверждать, что несмотря на что раковые клетки могут секретировать протеасомы с помощью везикул, у них существует другой механизм транспорта внеклеточных протеасом.

The most part of regulated proteolysis is made by ubiquitin-proteasome system. Recently it was shown that proteasome is not just an intracellular protein, but also can be found in extracellular fluids. The concentration of extracellular proteasomes is important for diseases development prognosis. Despite this, the origin of extracellular proteasomes remains unknown. There are data showing that proteasomes subunits and even fully functioning proteasomes are found in extracellular vesicles. There are several types of extracellular vesicles: exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Apoptotic bodies are remains of cells, died during the apoptosis, microvesicles are shedding from plasmatic membrane of the cell, and exosomes are formed inside of multivesicular bodies, which fuse with plasmatic membrane and release the exosomes. We fractioned the K562 and RPMI-8226 conditioned cell media with differential centrifugation. We did not find proteasomes in K562 microvesicles and only small quantity of proteasomes was shown in K562 exosomes. The similar results were obtained for RPMI-8226 vesicles, with the only difference being small quantity identified in microvesicles fraction. However, the main proteasome pool was detected in vesicle-less fraction. To exclude the possibility of vesicle destruction during centrifugation we used vesicle transport inhibitors DMA and blebbistatin. These inhibitors did not affect the extracellular proteasome concentration in the cell conditioned media. According to information received we can deduce that despite the capacity of cancer cell to vesicular secretion of proteasomes, another extracellular proteasomes transport mechanism should exist.