РЕЦЕНЗИЯ на выпускную квалификационную работу обучающегося СПбГУ Ланцевой Кристины Сергеевны по теме “Роль экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом раковыми клетками человека” Представленная к защите выпускная квалификационная работа Ланцевой Кристины Сергеевны посвящена изучению вопроса о предполагаемом участии экзосом и микровезикул в экспорте протеасом во внеклеточное пространство раковыми клетками человека. Внеклеточные протеасомы, циркулирующие в плазме крови являются потенциальными диагностическими биомаркерами для различных злокачественных преобразований клеток. В настоящее время ведутся обширные исследования о зависимости различных заболеваний, в частности раковых, с количеством внеклеточных протеасом. Однако механизмы появления этих внеклеточных протеасом еще далеки от понимания. Поэтому новизна и актуальность поставленной задачи исследования о транспорте внеклеточных протеасом раковыми клетками является бесспорной. Содержание ВКР соответствует заявленной в названии теме, четко сформулирована цель исследования и задачи, решение которых обеспечивает раскрытие темы. В работе поставлено 2 задачи и в разделе результаты приведено решение этих задач с сопутствующими иллюстративными материалами, по итогам которых сделано 2 вывода. ВКР построена по стандартному плану, к структуре работы замечаний нет. В разделе «Обзор литературы» рассматриваются структура и функции протеасом как внутри-, так и внеклеточных, и возможные механизмы их экспорта из клетки. Автором проанализировано большое количество литературы, в том числе цитируются работы последних лет, что подчеркивает актуальность исследования. В этом разделе остается не раскрыт вопрос о физическом размере протеасом и соотнесение его с размером микровезикул и экзосом.  Раздел «Материалы и методы» изложен достаточно подробно. Использованные в работе методы являются современными, технологически сложными методами молекулярной биологии. Однако есть некоторые упущения. Так, не приведено описание процедуры, использованной для лизиса осадка микровезикул и очищенных экзосом, а также подготовка проб кондиционированной среды для дальнейшего анализа методом иммуноблотинга? Далее следуют разделы «Результаты» и «Обсуждение», в которых представлены данные, полученные в ходе выполнения работы, и проведено сравнение полученных результатов с последними данными других исследователей в этой области. В представленной работе показано, что в среде культивирования раковых клеток человека (K-562 и RPMI-8226) с течением времени происходит накопление функционально активных протеасом. Целью исследования является решение вопроса о механизмах появления этих интактных внеклеточных протеасом и, в частности, роли экзосом и микровезикул. Первой задачей работы является поэтапное разделение среды, кондиционированной раковыми клетками человека, на фракции, содержащие соответствующие везикулы, и фракцию, обедненную везикулами. Однако в описании результатов решение этой задачи опущено. Краткое описание фракционирования дается только в главе Материалы и методы. Возможно, либо не следовало выносить этот пункт, как задачу исследования, либо более детально остановиться на его описании. Для лучшего представления результатов было бы уместно разместить схему, демонстрирующую этапы центрифугирования и фильтраций для понимания состава отбираемого компонента и условий, при которых это происходит. Автором было установлено, что при изначально выбранных условиях фракционирования среды, протеасомы не выявляются ни во фракции экзосом, ни во фракции микровезикул. При смягчении условий центрифугирования минорная часть внеклеточных протеасом определялась в экзосомах и микровезикулах. Однако, при ингибировании выхода экзосом или формирования микровезикул специфическими ингибиторами, не было обнаружено изменения количества внеклеточных протеасом, что свидетельствует о несущественности роли этих везикул, а вкладе альтернативного механизма транспорта протеасом, который используется раковыми клетками. Поставленные перед соискателем задачи исследования в представленной работе достигнуты, а по полученным результатам сформулированы обоснованные выводы. ВКР Ланцевой К.С. соответствует требованиям итоговой государственной аттестации бакалавра. В целом, несмотря на некоторые замечания, работа производит благоприятное впечатление, и заслуживает отличной оценки.   Вопросы 1 - Для чего клетки выдерживали в бессывороточной среде в течение ночи перед снятием для анализа внеклеточных протеасом? 2 - Как определяли пул внеклеточных протеасом в нулевой временной точке? По представленным данным иммуноблотинга (Рис. 3) в нулевой временной точке КС клеток K-562 абсолютно не содержит протеасом. Через 30 минут детектируется высокое содержание протеасом, которое остается практически неизменным на протяжении многих часов. Не имеет ли смысл изучать транспорт протеасом вне клетки именно в начальные времена, когда происходит интенсивное обогащение КС протеасомами? В статье (Bochmann et al., 2014), где обнаруживают протеасомы во фракции, содержащей экзосомы, анализ проводили через 45 минут после индукции изучаемыми агентами.  3 - Вопрос к рисунку 5: должны ли присутствовать экзосомы и соответствующее им окрашивание на CD63 в кондиционированной клетками среде (КС)? 4 - Клетки RPMI-8226, в отличие от К-562, содержат активирующие мутации в генах N-ras и K-ras. Онкогенный Ras стимулирует экзоцитоз. Какая наблюдается динамика накопления внеклеточных протеасом в кондиционированной клетками RPMI-8226 среде (проводился ли эксперимент, аналогичный представленному на рисунке 3)?  к.б.н., ст. науч. сотр. Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии РАН, 				Иготти М.В.