Improvement of approaches to study amyloid aggregates in the yeast Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Совершенствование методов изучения амилоидных агрегатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Прион [PSI+] – это генетический детерминант, обнаруженный у дрожжей. Белок Sup35, агрегация которого приводит к образованию приона [PSI+], в норме участвует в терминации трансляции. Для изучения агрегатов Sup35 широко используют метод полуденатурирующего агарозного гель-электрофореза (SDD-AGE), который позволяет оценить наличие и сравнить размер агрегатов. Размер агрегатов легко сравнить в пределах одного геля, однако сравнение разных экспериментов затруднительно. В рамках решения этой проблемы мы предприняли попытку разработать молекулярный маркер для определения размера агрегатов на основе мышц животных, а также на основе коммерческого набора маркеров молекулярного веса ДНК. Мы выяснили, что набор маркеров молекулярного веса ДНК более удобен для оценки размера крупных белковых комплексов с помощью SDD-AGE, чем мышечные экстракты животных. Кроме того, мы проанализировали некоторые факторы, которые могут влиять на размер агрегатов. В частности, известно, что диапазон размера агрегатов зависит от оптической плотности при сборе культуры. Это может быть причиной артефактов при сравнении культур с разной оптической плотностью. Мы провели эксперимент с выделением белка из культур, находящихся на разных стадиях роста и выяснили, что диапазон размера агрегатов зависит от оптической плотности при сборе культуры, поэтому для анализа размеров агрегатов Sup35 очень важно использовать культуры на одинаковой стадии роста. Наконец, при анализе амилоидных агрегатов используют разные способы выделения белка из клеток дрожжей: с помощью стеклянных шариков, которая имеет ряд недостатков, а также методика выделения белка из сферопластов. В ходе работы мы провели сравнение этих методов и оптимизировали методику выделения белка. Модифицированный протокол выделения белка из сферопластов, на основе метода, предложенного Халфманном и Линдквист, не уступает механическому способу, предложенному Кушнировым и др.

Improvement of approaches to study amyloid aggregates in the yeast Saccharomyces cerevisiae The [PSI+] prion is a genetic determinant, which was detected in yeast. The Sup35 protein, the aggregation of which leads to the formation of the [PSI+] prion, normally participates in the termination of translation. The method of semi-denaturing agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) is widely used to study Sup35 aggregates. It allows you to assess the presence of aggregates and compare their sizes . The sizes of aggregates can easily be compared within a single gel; however, comparison of different experiments is difficult. To solve this problem, we attempted to develop a molecular weight ladder for precise determinination of aggregate sizes using either protein extracts from animal muscles, or a commercial set of molecular weight DNA ladder. We found out that the DNA ladder was more convenient for estimating the size of large protein complexes through SDD-AGE than the protein extracts from animals muscles. Besides, we analyzed some factors that may affect aggregate size. For instance, it is known that the range of aggregate sizes depends on the optical density of the culture when collecting cells. This cause artifacts when comparing cultures with different optical densities. We carried out an experiment extracting protein from cultures at different growth stages and found that the range of aggregate size depended on the optical density at cell collection. So, it is very important to use cultures at the same growth stage to analyze the size of Sup35 aggregates. Finally, different methods of protein extraction are used for analysis of amyloid aggregates: cells can be lyses with glass beads (this methods has a number of drawbacks), or processed into spheroplasts and lysed more easily. In this work, we compared these methods and optimized the latter.The modified protocol for protein extraction from spheroplasts, based on the method proposed by Halfman and Lindquist, works equally well to the glass bead disruption method proposed by Kushnirov et al.