Characteristics of antibiotic activity of synthetic analogues of natural peptides of innate immunity having beta-hairpin conformation

Abstract

Аннотация Проблема выработки резистентности бактерий к антибиотикам является серьезным вызовом для современной медицины и определяет необходимость поиска новых эффективных антимикробных препаратов. Прототипами таких новых препаратов могут стать синтетические аналоги природных антимикробных пептидов (АМП) врожденного иммунитета. Одной из наиболее перспективных групп таких АМП являются пептиды, имеющие конформацию β-шпильки. Целью работы явился сравнительный анализ антимикробной и гемолитической активности β-шпилечных АМП - танатина, шучина-4, ареницина-1, протегрина-1 и его структурных модификаций: PG1 sh, АП 7, АП 10, АП 75, АП- 1, АП- 2b, АП- 6. Данные структурные модификации были разработаны С.С. Тереховым и исследованы в ходе совместной работы с Институтом биоорганической химии РАН им. ак. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. Методом серийных разведений в жидкой питательной среде определены минимальные ингибирующие концентрации исследуемых АМП в отношении четырёх видов бактерий: Escherichia coli ML35p, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Установлено, что из синтетических аналогов природных бета-шпилечных пептидов наиболее выраженную активность в отношении всех исследованных штаммов бактерий демонстрирует протегрин-1 (PG1). Из структурных модификаций PG1 наиболее активными оказались пептиды PG1 sh, АП-7 и АП-6. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) укороченного аналога протегрина-1 (PG1 sh) против бактерий E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus составила 0,5; 0,125; 1 и 0,0625 мкМ; для АП-7 - 0,5; 0,125; 1 и 2 мкМ, а для АП-6 - 0,5; 1, 2 и 0,5 мкМ, соответственно. С помощью фотометрического метода оценки влияния пептидов на проницаемость мембран E.coli ML-35p для хромогенных маркеров установлено, что наиболее выраженный эффект на проницаемость наружной мембраны бактерии оказывают Shu-4, PG-1 и АП-2b, а на проницаемость цитоплазматической мембраны - PG-1 и его синтетические аналоги АП-75 и АП-10. При этом АП 7 имеет относительно менее выраженное действие на цитоплазматическую мембрану бактерии по сравнению с другими исследованными пептидами. Оценка цитотоксической активности пептидов в отношении клеток человека была исследована путем сравнительного анализа способности АМП вызывать гемолиз, установлено, что наименьшей гемолитической активностью обладает танатин, который не оказывает повреждающего эффекта на эритроциты человека в исследованном диапазоне концентраций от 2.5 до 100 мкМ. Среди модификаций PG1 наиболее безопасным для клеток человека можно считать АП 7 (в концентрации 128 мкМ вызывал лизис 32 % эритроцитов). Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа антимикробной и гемолитической активности синтетических аналогов β-шпилечных АМП можно сделать вывод, что с точки зрения практического применения синтетическая модификация протегрина 1 - АП-7 (аналог с заменами двух остатков аргинина на лизин) является наиболее перспективным из исследованных пептидов, так как этот пептид сочетает высокую антимикробную активность в отношении бактерий и низкую гемолитическую активность.

Работа состоит из 3 глав, изложенных на 60 страницах, включает 11 иллюстраций. Список использованной литературы содержит 61 источник. Ключевые слова: β-шпилечные антимикробные пептиды, врожденный иммунитет, антимикробная активность, цитотоксическое действие, бактериальные мембраны.

Summary The problem of growing bacterial resistance to antibiotics is a serious challenge for modern medicine. It determines the urgent need to search for new effective antimicrobials. Natural antimicrobial peptides (AMPs) of the innate immunity can be considering as prototypes of such new drugs. The peptides adopting a β-hairpin conformation represent one of the most promising groups of AMPs for the practical application. The aim of the present work was a comparative analysis of the antimicrobial and hemolytic activities of β-hairpin AMPs - thanatin, shuchin-4, arenicin-1, protegrin-1 and its structural variants: PG1 sh, AP 7, AP 10, AP 75, AP- 1, AP- 2b, AP- 6. These structural modifications were developed by S.S. Terekhov and investigated in the course of a collaborative work with the Institute of Bioorganic Chemistry RAS named after M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov. The minimum inhibitory concentrations of the studied AMPs were determined for four bacterial species: Escherichia coli ML35p, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus by use the broth microdilution assay. It was found that among the synthetic analogues of natural β-hairpin peptides, protegrin-1 (PG1) demonstrates the most pronounced activity against all studied bacterial strains. The structural modifications of PG1 such as PG1 sh, AP-7 and AP-6 revealed the highest activity. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the truncated protegrin-1 analog (PG1 sh) against bacteria E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus were 0.5; 0.125; 1 and 0.0625 µM; for AP-7 - 0.5; 0.125; 1 and µM, and for AP-6 - 0.5; 1, 2 and 0.5 µM, respectively. Using a photometric method to assess the effect of the peptides on the permeability of E.coli ML-35p membranes for chromogenic markers we have shown that Shu-4, PG-1 and AP-2b demonstrated the most pronounced effect on the permeability of the outer bacterial membrane, while PG-1 and its synthetic analogues AP-75 and AP-10 had the most marked influence on the permeability of the cytoplasmic membrane. At the same time, AP 7 showed a relatively less pronounced effect on the cytoplasmic membrane of the bacteria compared to other peptides studied. Evaluation of the cytotoxic activity of the peptides against human cells was carried out by comparing the ability of AMPs to cause hemolysis. It was found that thanatin had the least hemolytic activity, it did not exert a damaging effect on human erythrocytes in the studied concentration range from 2.5 to 100 µM. Among the PG1 modifications, AP 7 can be considered as the least toxic for human cells (at a concentration of 128 µM, it caused lysis of 32% of red blood cells). Thus, as a result of a comparative analysis of the antimicrobial and hemolytic activity of synthetic analogues of β -hairpin AMPs, it can be concluded that from the point of view of a practical application, the synthetic modification of protegrin 1 - AP-7 (an analog with substitutions of two arginine residues with lysine) is the most promising substance among the studied peptides, since this peptide combines a high antimicrobial activity against bacteria and a low hemolytic activity. The work consists of 3 chapters, set out on 60 pages, includes 11 illustrations. The list of references contains 61 sources. Keywords: β-hairpin antimicrobial peptides, innate immunity, antimicrobial activity, cytotoxic effect, bacterial membranes.