Development of the test-system for assesement of eferocytosis effectivity

Abstract

На ранних стадиях атеросклероза инфильтрация липопротеинов низкой плотности (LDL) в интиму сосудов вызывает активацию эндотелиоцитов, рекрутирование моноцитов из кровотока и их диференцировку в макрофаги в стенке сосуда. Выработка активных форм кислорода эндотелиоцитами и макрофагами в условиях провоспалительного окружения приводит к окислению LDL и усугублению воспаления, а захват окисленных LDL макрофагами, не ограниченный какой-либо отрицательной обратной связью — к их гибели в результате стресса ЭПР. Погибшие апоптозом макрофаги должны быть удалены из интимы как можно раньше во избежание их вторичного некроза, утечки токсичных соединений из атеросклеротической бляшки, ее разрушения и образования тромба. А значит, эффективность эффероцитоза, или фагоцитоза погибших апоптозом клеток, определяет стабильность бляшки и вероятность развития смертельно опасных осложнений атеросклероза. Данная работа посвящена созданию физиологически релевантной тест-системы для оценки эффективности эффероцитоза и исследования его механизмов. В качестве фагоцитов использовали как первичные макрофаги, дифференцированные из моноцитарной фракции мононуклеаров периферической крови человека, так и макрофаги, дифференцированные из клеток линии ТНР-1. Апоптотические "клетки-мишени" были получены при суточной инкубации клеток линии Jurkat с 10 μM камптотецина. Тест-система показала свою пригодность для детекции с помощью метода проточной цитометрии, а использование конфокальной микроскопии позволило провести количественный анализ эффективности эффероцитоза. Полученные данные позволили выявить различия в механизме регуляции участвующей в эффероцитозе рецепторной тирозин-киназы Mer (MERTK) у мыши и человека, Предположительная причина этого — мутация в сайте связывания liver x receptor (LXR) человеческого гена MERTK, выявления с помощью биоинформатического выравнивания промоторных областей генов МERTK человека и мыши.

Low-density lipoprotein (LDL) infiltration into the vascular intima in the atherosclerosis early stages causes activation of endothelial cells, recruitment of monocytes from the bloodstream and their differentiation into macrophages in the vessel wall. Reactive oxygen species production by endotheliocytes and macrophages in a pro-inflammatory environment leads to LDL oxidation and inflammation enhancement/exacerbation. Finally, oxidized LDL uptake by macrophages not limited by any negative regulation leads to their death due to ER stress. The macrophages killed by apoptosis should be removed from the intima as early as possible in order to avoid their secondary necrosis, leakage of toxic compounds from the atherosclerotic plaque, its destruction and thrombus formation. Hence, efficiency of the eferocytosis, or phagocytosis of apoptotic cells, determines the plaque stability and the probability of atherosclerosis deadly complications development. This work is aimed at the development of a physiologically relevant test system for the eferocytosis assay and its mechanisms investigation. Both peripheral blood mononuclear cells and THP-1 -derived macrophages were used as phagocytes. Apoptotic "target cells" were obtained by 24-h incubation of Jurkat cells with 10 μM camptothecin. The test system has shown its suitability for detection using the flow cytometry, and the quantitative analyze of the efferocytosis effectiveness was made via confocal microscopy. Obtained data made it possible to reveal differences in the mechanism of regulation of the receptor tyrosine kinase Mer (MERTK) involved in eferocytosis in mice and humans. The presumptive reason for this is a mutation in the liver x receptor (LXR) binding site of the human MERTK gene, identified using bioinformatic alignment of the promoter regions of genes MERTK human and mouse.