Elaboration of expression system for recombinant proteins in Enterococcus spp. cells

Abstract

В настоящее время актуален поиск новых систем экспрессии рекомбинантных генов в клетках самых разных микроорганизмов. Результаты этих исследований могут в перспективе способствовать созданию рекомбинантных штаммов энтерококков, которые могут быть применены в качестве «живых вакцин» - безопасных пробиотических штаммов, экспрессирующих антигенные белки патогенных бактерий. В настоящей работе на основе вектора pAT29 была создана рекомбинантная плазмида, содержащая ген флуоресцентного белка TurboRFP, помещенный под контроль промотора гена entA пробиотического штамма E.faecium L-3. Штаммы E.coli JM109, содержащие созданную плазмиду, обладали характерным флуоресцентным фенотипом за счет экспрессии гена turborfp. Методом электропорации плазмида была внедрена в клетки Enterococcus faecium A64, в результате чего был получен штамм, содержащий рекомбинантную плазмиду, однако проявлений флуоресцентного фенотипа не наблюдалось. В качестве контроля для электропорации штамма E.faecium A64 была использована плазмида pBSU101, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка egfp. В результате был получен штамм, способный экспрессировать ген egfp, что выражалось в появлении флуоресценции у колоний энтерококка. Таким образом, было определено, что созданная рекомбинантная плазмида может быть использована для доставки целевых генов в клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий. При изучении стабильности плазмиды pBSU101 в клетках E.faecium A64 было показано, что при отсутствии селективного фактора в среде происходит постепенная элиминация вектора из клеток энтерококков.

Nowadays, the active search for new systems for the expression of recombinant genes in cells of various microorganisms is actual. In the future the results of these studies may contribute to the creation of recombinant strains of enterococci, which could be used as "live vaccines" - safe probiotic strains expressing the antigenic proteins of pathogenic bacteria. In the present work, a recombinant plasmid was created based on the vector pAT29. The plasmid contains the promoterless copy of the gene of fluorescent protein TurboRFP, placed under the control of the promoter of the entA gene of probiotic E.faecium L-3 strain. E. coli JM109 strains, containing the created plasmid had a specific fluorescent phenotype due to the expression of the turborfp gene. The plasmid was introduced into Enterococcus faecium A64 cells by electroporation. As a result an enterococcal strain, containing a recombinant plasmid was obtained; however, no fluorescence phenotype appearance was observed. As a control for electroporation of the strain E.faecium A64, the plasmid pBSU101 containing the gene for green fluorescent protein eGFP was used. As a result, a strain capable to express the egfp gene was obtained, and fluorescence of enterococcal colonies was detected. Thus, it was determined that the generated recombinant plasmid could be used to deliver the target genes into cells of gram-positive and gram-negative bacteria. During studying of the stability of the plasmid pBSU101 in E.faecium A64 cells, it was shown that in the absence of a selective factor (antibiotic) in the medium, the vector is gradually eliminated from enterococcal cells.