Studying properties of fibrocytes derived from monocytic cell line THP-1 with JAK2 V617F mutation

Abstract

Фиброциты – клетки веретеновидной формы производные CD14+ моноцитов, которые обладают особенностями как гемопоэтических так и стромальных клеток Не смотря на их небольшую долю от циркулирующих лейкоцитов в норме, они играют важную роль во многих патологических состояниях, связанных с фиброзом, в частности с первичным миелофиброзом. Первичный миелофиброз относится к Ph негативным заболеваниям, основным критерием определения которого служит миелофиброз – явление, разрастания коллагеновых волокон в красном костном мозге с последующим вытеснением гемопоэтической ткани в другие органы и нарушением гемопоэза. Отсутствие соответствующей терапии миелофиброза связано с его неясной этиологией. Считается, что первичный миелофиброз развивается в результате злокачественной трансформации в гемопоэтических стволовых клетках, что приводит к нарушению клеточных сигнальных путей, регулирующих клеточный рост, активацию, дифференцировку, адгезию и апоптоз. Клональная миелопролиферация сопровождается изменением стромы костного мозга и патологической выработкой цитокинов и металлопротеиназ, которые могут участвовать в нарушении межклеточных взаимодействий нейтрофилов, моноцитов и мегакариоцитов, приводя к выходу CD34+ миелоидных предшественников и эндотелиальных клеток в периферическую кровь. Первоначальная причина, ведущая к злокачественной трансформации неизвестна, однако, для значительной части пациентов с первичным миелофиброзом наиболее характерна точечная мутация в гене янускиназы JAK2 V617F, которая приводит к гиперактивации янускиназы и фосфорилированию белков - мишеней в отсутствие стимуляции рецепторов, к запуску JAK-STAT сигнального пути и избыточной пролиферации миелоидного ростка. В связи с тем, что молекулярные механизмы первичного миелофиброза не ясны была поставлена цель получить фиброциты с мутацией JAK2 V617F, ассоциированной с развитием миелофиброза, и охарактеризовать профибротические свойства этих клеток. В задачи входило: 1) оптимизировать условия дифференцировки моноцитов в фиброциты на основе клеточной линии моноцитов ТНР-1. 2) выявить маркеры фиброцитов (в частности коллаген). 3)получить фиброциты из моноцитов ТНР-1 трех типов, используя условия, оптимизированные на первом этапе работы, и сравнить профибротические свойства этих клеток, а именно: А )Сравнить морфологию ТНР Б) Проанализировать количество матриксных металлопротеиназ. В) Оценить влияние ТНР на синтетическую активность МСК (на синтез коллагена). С помощью методов иммунофлюоресценции, цитофлюорометрии, вестерн блоттинга и желатиновой зимографии, а также морфометрии были получены результаты, которые привели к следующим выводам: 1)Общепринятый протокол получения фиброцитов из первичной культуры периферических мононуклеаров крови в бессывороточной среде не подходит для получения фиброцитов из клеточной линии моноцитов ТНР 1. Добавление форболового эфира в среду культивирования приводит к дифференцировке моноцитов, при этом образуется смешанная популяция клеток, морфологически схожих как с макрофагами, так и с фиброцитами. Уменьшение содержания сыворотки и форболового эфира в среде культивирования увеличивает долю веретеновидных клеток, схожих с фиброцитами. 2)Прямое сокультивирование моноцитов линии ТНР-1 и КМ МСК позволяет получить адгезионные моноциты без применения форболового эфира в бессывороточных условиях. При этом клетки прикрепляются вдоль коллагеновых фибрилл или на поверхность КМ МСК. 3)Моноциты ТНР-1, активированные форболовым эфиром, синтезируют маркер фиброцитов – коллаген I типа. Доля клеток, положительных по коллагену I типа, составляет 47%. 4)Активированные форболовым эфиром моноциты ТНР-1, несущие мутацию JAK2 V617F, достоверно более вытянутые, чем немодифицированные клетки дикого типа, что указывает на сдвиг в сторону образования фиброцитов. 5)Клетки ТНР-1 с экспрессией JAK2 синтезируют повышенное количество ММР2 по сравнению с немодифицированными клетками. 6)Моноциты THP-1 с мутацией JAK2 V617F стимулируют синтез коллагена в клетках КМ МСК, что свидетельствует о возможной роли моноцитов в патогенезе миелофиброза.

Fibrocytes are spindle-shaped cells derieved from CD14 + monocyte and have features both hemopoietic and stromal cells. Despite their small proportion of circulating white blood cells, they play an important role in many pathological conditions associated with fibrosis, in particular with primary myelofibrosis. Primary myelofibrosis refers to Ph negative diseases, the main criterion for determining which is myelofibrosis, the proliferation of collagen fibers in the red bone marrow, followed by the displacement of hemopoietic tissue into other organs and the violation of hemopoiesis. The absence of appropriate therapy myelofibrosis is due to its unclear etiology. It is believed that primary myelofibrosis develops as a result of malignant transformation in hematopoietic stem cells, which leads to disruption of cellular signaling pathways that regulate cell growth, activation, differentiation, adhesion and apoptosis. Clonal myeloproliferation is accompanied by a change in the stroma of the bone marrow and pathological production of cytokines and metalloproteinases that can participate in the disturbance of the intercellular interactions of neutrophils, monocytes and megakaryocytes, leading to the release of CD34 + myeloid progenitors and endothelial cells into the peripheral blood. The original cause leading to malignant transformation is not known, however, for most of the patients with primary myelofibrosis, the most common point mutation in the JAK2 V617F gene of januskinase, which leads to the inactivation of the Ianuskinase and the phosphorylation of target proteins in the absence of stimulation of the receptors, to the launch of the JAK-STAT signaling pathway and excess proliferation of myeloid lineage. Due to the fact that the molecular mechanisms of primary myelofibrosis were not clear, the goal was to obtain fibrocytes with a JAK2 V617F mutation associated with the development of myelofibrosis and to characterize the pro-fibrotic properties of these cells. The tasks included: 1) to optimize the conditions for the differentiation of monocytes into fibroblasts based on the THP-1 monocyte cell line. 2) identify markers fibrocytes (especially collagen). 3) to obtain fibrocytes from THP-1 monocytes of three types, using conditions optimized at the first stage of the work, and to compare the pro-fibrotic properties of these cells, namely: A) Compare the morphology of THP B) Analyze the number of matrix metalloproteinases. B) To evaluate the effect on the synthetic activity of THP MSCs (collagen synthesis). Immunofluorescence, cytofluorometry, western blotting and gelatinous zymography, as well as morphometry, yielded results that led to the following conclusions: 1) The generally accepted protocol for the production of fibroblasts from the primary culture of peripheral blood mononuclear cells in a serum-free medium is not suitable for the production of fibrocytes from the monocyte cell line THP 1. The addition of phorbol ester to the culture medium leads to the differentiation of monocytes, thus forming a mixed population of cells, morphologically similar like with macrophages and with fibrocytes. Reducing the serum and phorbol ester in the culture medium increases the proportion of spindle cells similar to fibroblasts. 2) Direct co-cultivation of monocytes of the line THP-1 and CM MSC allows to obtain adhesion monocytes without the use of phorbol ester in serum-free conditions. Wherein cells are attached along the collagen fibrils or onto KM MSCs. 3) THP-1 monocytes, activated with phorbol ester, synthesize the marker of fibrocytes - type I collagen. The proportion of cells positive for collagen type I is 47%. 4) Phorbol-ester-activated THP-1 monocytes bearing the JAK2 V617F mutation are significantly more elongated than unmodified wild-type cells, indicating a shift towards the formation of fibroblasts. 5) THP-1 cells with JAK2 expression synthesize an increased amount of MMP2 as compared to unmodified cells. 6) THP-1 monocytes with a JAK2 V617F mutation stimulate the synthesis of collagen in CM cells of MSC, which indicates the possible role of monocytes in the pathogenesis of myelofibrosis.