Study of the possibilities of the metabolomic profile of plants with antiviral and antibacterial activity, obtained in vitro by chromatography and capillary electrophoresis

Abstract

Выпускная квалификационная работа посвящена разработке подходов к селективному извлечению фенольных соединений, аминокислот и органических кислот из биотехнологического сырья видов Iris L. с дальнейшим получением профилей биологически активных аналитов методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и капиллярного зонного электрофореза и выявления закономерностей их концентрационных изменений в зависимости от содержания фитогормонов в питательных средах. Объектом исследования выступало биотехнологическое сырьё Iris sibirica L. и Iris ensata L., выращенное в аэропонике и на питательных средах Мурасиге-Скуга с различным содержанием фитогормонов цитокинина 6-бензиламинопурина (6-БАП) и ауксина α-нафтилуксусной кислоты (α-НУК) (сырье получено на базе Института химии и химико-фармацевтических технологий АлтГУ). Определение флавоноидов и аминокислот проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, для органических кислот был выбран метод капиллярного электрофореза. Выбраны условия хроматографического и хроматомасс-спектрометрического определения флавоноидов и аминокислот в экстрактах Iris L. методом ОФ ВЭЖХ с градиентным режимом элюирования. Разработаны схемы подготовки проб растительных объектов для эффективного извлечения флавоноидов и аминокислот из листьев ирисов c применением дизайна эксперимента. Использование математических подходов позволило выявить основные факторы, влияющие на эффективность экстракции аналитов (взаимодействие температуры и времени нагрева, а также содержание метанола – для флавоноидов; температура нагрева и содержание метанола – для аминокислот) и установить оптимальные условия извлечения для полифенолов – экстракция 100% метанолом при 65°С в течение 15 мин, для аминокислот – экстракция 50% метанолом с добавкой 100 мкл HCl конц при 70°С в течение 20 мин. Выбранные условия пробоподготовки и разделения аналитов при анализе экстрактов листьев биотехнологического сырья Iris L. обеспечили получение характеристических профилей флавоноидов, аминокислот и органических кислот экстрактов биотехнологического сырья Iris L. и позволили выявить закономерности накопления аналитов в зависимости от гормонального состава питательной среды. Методом ОФ ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения проведена предварительная идентификация фенольных соединений (37 соединений), которые относятся к классам изофлавоноидов, ксантонов, флавонов и фенольных кислот. Разработан экспрессный вариант контроля биотехнологического сырья по содержанию флавоноидов методом ВЭТСХ с денситометрическим детектированием и показана перспективность его применения для получения характеристических профилей растительного сырья.

The final qualification paper is devoted to the development of approaches to the selective extraction of phenolic compounds, amino acids and organic acids from biotechnological raw materials of Iris L. species with further obtaining profiles of biologically active analytes by reverse-phase HPLC and capillary zone electrophoresis and identifying patterns of their concentration changes depending on the content of phytohormones in nutrient media. The object of the study was biotechnological raw materials Iris sibirica L. and Iris ensata L., grown in aeroponics and on Murashige-Skoog nutrient media with different contents of phytohormones 6-benzylaminopurine (6-BAP, cytokinin) and α-naphthylacetic acid (α-NAA, auxin) (the raw plant materials were obtained on the basis of the Institute of Chemistry and Chemical-Pharmaceutical Technologies of Altai State University). The determination of flavonoids and amino acids was carried out by reverse-phase HPLC, for organic acids the method of capillary electrophoresis was chosen. The conditions of chromatographic and chromatomass spectrometric determination of flavonoids and amino acids in Iris L. extracts by the method of HPLC with gradient elution mode were selected. Schemes of sample preparation of plant objects for the effective extraction of flavonoids and amino acids from the leaves of irises using design of experiment have been developed. The use of mathematical approaches made it possible to identify the main factors affecting the efficiency of analyte extraction (the interaction of temperature and heating time, as well as the methanol content for flavonoids; heating temperature and methanol content for amino acids) and establish optimal extraction conditions for polyphenols – extraction with 100% methanol at 65 ° C for 15 minutes, for amino acids – extraction with 50% methanol with the addition of 100 µl HCL conc at 70 ° C for 20 minutes. The selected conditions for sample preparation and separation of analytes in the analysis of extracts of leaves of biotechnological raw materials Iris L. provided the obtaining of characteristic profiles of flavonoids, amino acids and organic acids of extracts of biotechnological raw materials Iris L. and allowed to identify patterns of accumulation of analytes depending on the hormonal composition of the nutrient medium. The preliminary identification of phenolic compounds (37 compounds), which belong to the classes of isoflavonoids, xanthones, flavones and phenolic acids, was carried out by the method of HPLC with tandem high-resolution mass spectrometry. An express version of the control of biotechnological raw materials for the content of flavonoids by the HPTLC method with densitometric detection has been developed and the prospects of its use for obtaining characteristic profiles of plant raw materials have been shown.