Macroporous flow-through bioreactors for fucoidan destruction

Abstract

Вследствие высокой специфичности и эффективности действия ферментов в процессах деструкции разнообразных субстратов использование гетерогенных биокатализаторов представляется весьма перспективным для производства пищевых добавок и биологически активных субстанций. Так, одной из крайне актуальных практических задач является разработка проточных биореакторов для получения биологически активных сахаров – фукозы и фукоолигосахаридов – из природного полисахарида фукоидана, источником которого являются бурые водоросли. В данной работе, с целью изучения и оптимизации процесса биодеструкции фукоидана была исследована возможность получения проточных биореакторов на основе α-L-фукозидазы, иммобилизованной на поверхности макропористых полиметакрилатных матриц монолитного типа. На первом этапе работы была продемонстрирована возможность контроля поровой структуры монолитных носителей за счет изменения условий их получения (температура, длительность синтеза, природа и соотношение порогенов, количество инициатора). В дальнейшем была проведена иммобилизация α-L-фукозидазы на поверхности выбранных материалов с использованием двух подходов, а именно, метода прямой иммобилизации фермента и путем введения промежуточного высокомолекулярного спейсера. Показано сохранение каталитической активности фермента на уровне 60% по сравнению с растворенной формой биокатализатора. Кроме того, положено начало в области разработки процедуры мониторинга биокаталитического процесса методом ВЭЖХ. В частности, разработана методика разделения фукозы и фукоидана методом анионообменной ВЭЖХ в условиях градиентного элюирования.

The using of heterogeneous biocatalysts based on enzymes is perspective for the food and pharmaceutical areas due to the high specificity and effectiveness in destruction of various substrates. In particular, the development of flow-through bioreactors for fucose and fuco-oligosaccharides from fucoidan, found in brown algae, producing is extremely urgent. In this work, α-L-fucosidase was immobilized onto a macroporous polymethacrylate monolithic column to study and optimize the biodegradation processes. Firstly, the ability to control the pore structure of monolithic carriers by changing the synthesis conditions (temperature, duration of synthesis, nature and ration of porogens, amount of initiator) was demonstrated. Secondly, the immobilization of α-L-fucosidase on the surface of the selected materials was conducted by using two approaches, namely, the method of direct immobilization of the enzyme and by introducing an intermediate high molecular weight spacer. It was shown that the enzyme retains 60% of its catalytic activity compared to the biocatalyst in solution. In addition, the development of a procedure for monitoring the biocatalytic process by HPLC was started. Particularly, a technique for the separation fucose and fucoidan by the method of anion-exchange HPLC under gradient elution conditions was developed.