Study of Deltaproteobacteria CasX nuclease

Abstract

CRISPR-Cas – защитные системы бактерий и архей. Они состоят из двух основных компонентов: CRISPR-кассеты и генов cas. На этапе экспрессии с CRISPR-кассеты транскрибируется длинная пре-crРНК, которая затем процессируется на зрелые молекулы crРНК. В это же время с генов cas экспрессируются cas белки, которые объединяются с crРНК в эффекторные комплексы и сканируют клетку на предмет чужеродных последовательностей. Например, при повторном заражении клетки бактериофагом комплекс специфически распознает его ДНК и расщепляет молекулу. Так, меняя только лишь последовательность crРНК, Cas белки можно легко направлять на разнообразные ДНК-мишени. Поэтому CRISPR-Cas системы быстро стали перспективными инструментами генного редактирования. Поиск и описание характеристик новых Cas белков из разных бактерий обеспечит универсальность и специфичность технологии геномного редактирования при помощи этой системы. Данная работа посвящена изучению нуклеазной активности белка CasX из Deltaproteobacteria. Целью исследования было собрать в условиях in vitro систему, состоящую из направляющей РНК, рекомбинантного белка DpbCasX и ДНК-мишени с известным РАМ. Для этого нами был сконструирован и получен плазмидный вектор для экспрессии системы pET21a CasX_MBP. Выделен и очищен рекомбинантный белок DpbCasX_MBP, синтезированы ДНК-мишени и направляющая РНК. В ходе экспериментов была показана активность эндонуклеазы DpbCasX. Кроме того, определен диапазон температур, в котором белок DpbCasX эффективнее всего расщепляет ДНК-мишень.

CRISPR-Cas is a bacteria and archaea protection system. It consists of two main components: CRISPR cassette and cas genes. During the expression stage, the CRISPR cassette is transcribed into long pre-crRNA that is then processed into mature crRNA. At the same time, cas proteins are expressed from cas genes, which combine with crRNA into effector complexes and scan the cell for foreign sequences. For example, when a cell is reinfected with bacteriophage, the complex specifically recognizes its DNA and cleavage the molecule. Thus, by changing only the sequence of crRNA, Cas proteins can be easily directed to a variety of target DNAs. Therefore, CRISPR-Cas systems quickly became promising tools for gene editing. Search and characterization of new Cas proteins from different bacteria will ensure the universality and specifity of the technology for genome editing using this system. This work is about the study of the nuclease activity of the CasX protein from Deltaproteobacteria. The aim of the study was to assemble in vitro a system consisting of a guide RNA, a recombinant protein DpbCasX and a DNA target with a known PAM. For this, we designed and obtained a plasmid vector for the expression of the pET21a CasX_MBP system. The recombinant protein DpbCasC_MBP was isolated and purified, the target DNA and guide RNA were synthesized. During the experiments, the activity of the endonuclease DpbCasX was shown. In addition, the temperature range in which the DpbCasX protein most efficiently cleaves the target DNA is determined.