Role of PIN-FORMED proteins in formation of auxin response maximum during lateral root initiation in Cucurbita pepo

Abstract

Работа посвящена изучению роли PIN-белков в формировании максимума клеточного ответа на ауксин при инициации боковых корней у кабачка (Cucurbita pepo L.). В ходе работы впервые показаны условия формирования локального максимума ауксина в меристеме корня кабачка в связи с инициацией примордиев бокового корня. Был осуществлен поиск гомологов белка PIN4 Cucumis sativus у Cucurbita pepo с использованием базы данных Phytozome, Cucurbit Genomics Database (cucurbitgenomics.org) и алгоритма BLAST. На основе филогенетического и транскриптомного анализа был выбран наиболее близкий к белку PIN4 Cucumis sativus гомолог кабачка. Был выполнен поиск, идентификация и клонирование промоторной и кодирующей последовательностей гена CpPIN1. Для локализации CpPIN1 в кончике корня кабачка была создана генетическая конструкция pKGW-RR-MGW-pCpPIN1::PIN1-NeonGreen-TermAct и проведена иммунолокализация белка, с помощью антител против AtPIN1, на трансгенных корнях кабачка, несущих репортерную конструкцию для визуализации максимумов клеточного ответа на ауксин (DR5::GFP-NLS). Анализ продольных срезов кончиков корней кабачка, содержащих вставку pCpPIN1::PIN1-NeonGreen-TermAct, показал, что паттерн распределения белка CpPIN1 на мембране клеток аналогичен паттерну распределения белка PIN1 у Arabidopsis. Иммунолокализация AtPIN1 в корнях кабачка показала, что PIN1, перераспределяясь на мембране, направляет ток ауксина в соседние клетки, создавая в них максимум клеточного ответа на ауксин. В процессе работы были освоены методы выделения плазмидной и геномной ДНК, выделения общей РНК, методы ПЦР, ПЦР с колоний, ПЦР с перекрывающимися праймерами и ПЦР с обратной транскрипции, технология клонирования Gateway, трансформация клеток Еscherichia coli и Agrobacterium rhizogenes, агробактериальная трансформация проростков кабачка, иммунолокализация растений, освоена техника приготовления продольных и поперечных с помощью микротома с вибрирующим лезвием, освоена техника лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

The work is devoted to the study of the role of PIN proteins in the formation of the maximum cellular response to auxin during the initiation of lateral roots in the squash (Cucurbita pepo L.). During the work, the conditions for the formation of a local auxin maximum in the zucchini root meristem in connection with the initiation of the side root primordias are shown for the first time. The search for homologues of the PIN4 protein Cucumis sativus from Cucurbita pepo was carried out using the Phytozome database, the Cucurbit Genomics Database (cucurbitgenomics.org) and the BLAST algorithm. Based on phylogenetic and transcriptome analysis, the homologue of the zucchini closest to the PIN4 protein, Cucumis sativus, was chosen. A search, identification and cloning of the promoter and coding sequences of the CpPIN1 gene has been performed. For localization of CpPIN1, the genetic construct pKGW-RR-MGW-pCpPIN1 :: PIN1-NeonGreen-TermAct was created at the tip of the zucchini root and protein immunolocalization was performed using anti-AtPIN1 antibodies on transgenic roots of the zucchini, carrying a reporter construct to visualize the cellular response maximum Auxin (DR5 :: GFP-NLS). An analysis of the longitudinal sections of the roots of the zucchini root, containing the pCpPIN1 :: PIN1-NeonGreen-TermAct insert, showed that the pattern of distribution of the CpPIN1 protein on the cell membrane is similar to the pattern of the distribution of the PIN1 protein in Arabidopsis. Immunolocalization of AtPIN1 in the roots of the zucchini showed that PIN1, being redistributed on the membrane, directs the auxin current to neighboring cells, creating in them a maximum of the cellular response to auxin. In operation, were utilized methods for isolation of plasmid and genomic DNA, isolation of total RNA, PCR techniques, PCR colonies, PCR with overlapping primers and PCR with reverse transcription, Gateway cloning technology, transformation of cells Escherichia coli and Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium-mediated transformation of seedlings zucchini plant immunolocalization; a longitudinal and transverse preparation technique was developed using a vibrating-blade microtome; a laser scanning confocal microscopy technique was mastered.