Screening for functional amyloids in Drosophila melanogaster oocytes

Abstract

Амилоиды представляют собой фибриллярные белковые агрегаты, образующие кросс-β-структуру. Первые работы по изучению амилоидов были связаны с их патологической ролью, но также известны белки, выполняющие в амилоидной конформации жизненно важные функции. Есть данные, что ряд структур в яичниках различных организмов окрашивается амилоид-специфичными красителями, однако более детальный анализ был проведен лишь для некоторых из них. В нашей лаборатории был разработан универсальный метод протеомного скрининга амилоидов (PSIA LC-MALDI), с его помощью мы идентифицировали белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты в яичниках Drosophila melanogaster. Нами также были проведены окрашивания криосрезов яичников амилоид-специфичными красителями Тиофлавином S и Конго красным. Было показано, что Тиофлавин S неравномерно связывается с поверхностью оболочки яйца, интенсивно окрашивая структуры pillars (столбики) – основной структурный компонент хориона. Окраска Конго красным показала, что данные столбики демонстрируют зеленое свечение в поляризованном свете. Сопоставив эти данные с результатами протеомного скрининга, мы выбрали наиболее перспективные белки-кандидаты на роль функциональных амилоидов яичников дрозофилы. Один из них – мажорный белок хориона s36, в случае подавления экспрессии гена которого нарушается структура оболочки яйца, не формируется микропиле, что препятствует оплодотворению и в последствии приводит к стерильности мух с данной мутацией. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности s36 выявил потенциально амилоидогенные регионы. В результате дальнейшего анализа мы показали, что гибридный белок CP36-YFP формирует в клетках дрожжей агрегаты, детектируемые при помощи флуоресцентной микроскопии. Таким образом, на данный момент мы можем рассматривать исследуемый белок в качестве кандидата на роль функционального амилоида в ооцитах Drosophila melanogaster.

Amyloids are the fibrillar protein aggregates with cross-β structure. The first works about amyloids were associated with pathologies, but proteins that play vital functions in the amyloid conformation are also known. There is evidence that some structures in the ovaries of various organisms are stained with amyloid-specific dyes, but the more detailed analysis was carried out for only a few of them. In our laboratory was created a universal method of Proteomic Screening and Identification of Amyloids (PSIA HPLC-MALDI). With its help, we identified proteins that form SDS-resistant aggregates in Drosophila melanogaster ovaries. We carried out the staining of ovary cryosections with amyloid-specific dyes Thioflavin S and Congo red. It was shown that Thioflavin S is unevenly bound with the eggshell surface, intensely staining the pillars – the main structural component of the chorion. Staining with Congo red demonstrated green birefringence of the pillars in polarized light. Comparing these results with the results of proteomic screening, we chose the most prospective candidates for the role of functional amyloid in the fruit fly’s ovaries. One of them is the major protein of chorion s36. If the expression of gene Cp36 (gene of s36 protein) is inhibited, the structure of the eggshell is disrupted, the micropyle does not form, which prevents fertilization and subsequently leads to the sterility of flies with this mutation. Bioinformatical analysis of the amino acid sequences of s36 also revealed potentially amyloidogenic regions. As a result of further analysis, we showed that the hybrid protein CP36-YFP forms aggregates in yeast cells detectable by fluorescence microscopy. Thus, we can consider the studied protein as a candidate for the role of functional amyloid in Drosophila melanogaster oocytes.