Creation and characterization of CHO cell-line clones with alphoid human artificial chromosome containing coagulation factor VIII gene

Abstract

Перспективным методом лечения гемофилии Б является искусственная хромосома человека (ИХЧ) с геном фактора VIII свёртывания крови. До нашей работы в лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток института цитологии РАН, была получена ИХЧ с геном фактора VIII свёртывания крови, под промотором CMV и геном EGFP под промотором CAG. Гены располагались голова к голове по отношению друг к другу. Ген F8 продуцировал FVIII фактор свёртывания крови в CHO клетках, но не продуцировал его в индуцированных плюрипотентных клетках. Наиболее вероятная причина отсутствия продукции F8 в индуцированных плюрипотентных клетках в том, что промотор CMV не экспрессируется в плюрипотентных клетках. Кроме того расположение двух генов «голова к голове» может вызывать транскрипционную индукцию более сильным промотором (CAG) , более слабого промотора (CMV), в результате чего ген (F8) расположенный под слабым промотором (CMV) не экспрессируется. Таким образом, возникла цель нашей работы получить и охарактеризовать линию CHO с искусственной хромосомой человека, содержащей ген F8 под конститутивным промотором EF1- α, геном EGFP под промотором CAG, а также инсуляторной последовательностью cHS4, разделяющей промоторы двух генов.

Human artificial chromosome (Hac) is a perspective method for Hemophilia B treatment . Before our work in laboratory of pluripotent cells molecular biology was got human artificial chromosome, which contain gene of FVIII coagulation factor with CMV promoter and EGFP gene with CAG promoter. Genes placed to each other so called «head to head». Unfortunately FVIII factor was producing in CHO cells, but not in induced pluripotent stem cells. The most probable reason for this is absence of expression CMV promoter in pluripotent cell. Another reason is that placing genes in «head to head» manner can induce transcription induction. That is a case when more strong promoter like CAG suppress transcription activity of more poor promoter expression. So initiate purpose of our work. Creation and characterization of CHO cell clones with Hac, which contain F8 gene with constitutive EF1- α promoter and also contain cHS4 insulator, which delimit both promotors.