Construction of biologically active recombinant proteins: Interleukin-36 gamma (IL-36g) and Interleukin-36 receptor antagonist (IL-36RA)

Abstract

Семейство интерелейкина-36 (ИЛ-36) включает в себя: 3 агониста ИЛ-36α, β, γ и один антагонист ИЛ-36РА. Агонисты, связываясь с их общим рецептором – ИЛ-36Р, активируют сигнальные пути NF-kВ и/или МАРК. Антагонист же, связываясь с ИЛ-36Р, препятствует передаче сигнала. Цитокины ИЛ-36 вовлечены в воспалительные процессы в коже, в том числе в патогенез псориаза. Псориаз - это аутоиммунное заболевание кожи, которое встречается примерно у 2% населения в развитых странах. При псориатическом воспалении резко повышается продукция провоспалительных цитокинов кожи - ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36γ -, в отдельных случаях в 100 раз. Среди них наиболее сильным маркером является ИЛ-36γ. Это позволяет использовать его в диагностических целях, как мишень антицитокиновой терапии, направленной на лечение псориаза, или для моделирования псориаза. Мутации в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, ассоциированы с развитием тяжелейшей формы псориаза – генерализованного пустулезного псориаза. Следовательно, ИЛ-36РА может служить потенциальным средством для лечения псориаза. В настоящей работе описано получение биологически активных рекомбинантных белков ИЛ-36РА и ИЛ-36γ человека. Для максимальной биологической активности молекулам ИЛ-36РА и ИЛ-36γ необходим протеолиз. Для получения биологически активной формы ИЛ-36РА важно отщепление N-концевого остатка метионина. Для получения биологически активной формы ИЛ-36γ важно отщепление N-концевого сигнального пептида, поэтому для получения рекомбинантного ИЛ-36γ мы использовали модифицированный ген IL36G, кодирующий уже процессированную форму ИЛ-36γ, которая начинается с 18-го а.к.о. серина. Однако биологическая активность такого рекомбинантного ИЛ-36γ недостаточно высокая по сравнению с препаратами описанными в литературе. Мы предположили, что причиной понижения биологической активности ИЛ-36γ также является недостаточно эффективное отщепление N-концевого остатка метионина. Для отщепления N-концевого остатка метионина ИЛ-36РА и ИЛ-36γ использовали метод коэкспрессии гена интереса с геном метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов, а также метод экзогенной обработки рекомбинантного белка ИЛ-36РА и ИЛ-36γ рекомбинантной МАП. В случае с рекомбинантным ИЛ-36РА оба метода позволили получить безметиониновые формы ИЛ-36РА с биологической активностью равной активности стандартного образца. Был получен оптимальный штамм- штамм-продуцент ИЛ-36РА – ИЛ-36РА-МАП-BAD. Анализ полученных препаратов проводили при помощи ИФА, ОФ-ВЭЖХ и биологического теста. К настоящему времени эксперимент с ИЛ-36γ не окончен, требуется дополнительный анализ с помощью масс-спектрометрии.

The interleukin-36 family (IL-36) includes three receptor agonists namely IL-36α, β, γ and one IL-36 receptor antagonist (IL-36Ra). The agonists activate NF-kB and/or MAPK signal pathways by binding to their receptor (IL-36R). While IL-36Ra interferes with signal transmission by binding to IL-36R without its activation. IL-36 cytokines are involved in the skin inflammatory processes including the psoriasis pathogenesis. Psoriasis is an immune-mediated inflammatory skin condition affecting approximately 2% of population in developed countries. The proinflammatory skin cytokines IL-36α, IL-36β, IL-36γ are overexpressed in psoriatic skin, sometimes up to 100-fold. IL-36γ is the most strong inflammation marker among them. This fact allows using IL-36γ for diagnostic purposes, as a target of anti-cytokine therapy for psoriasis treatment and for the psoriasis modeling. Mutations in gene encoding IL-36Ra (IL36RN) are associated with the development of generalized pustular psoriasis – the most severe form of psoriasis. Hence, recombinant IL-36Ra potentially can be used for psoriasis treatment. This work describes the production of biologically active recombinant human IL-36Ra and IL-36γ. Both IL-36Ra and IL-36γ require proteolysis to obtain maximum biological activity. To obtain the biologically active form of IL-36Ra the cleavage of its N-terminal methionine residue is crucial. The N-terminal signal peptide cleavage is necessary to obtain the biologically active form of IL-36γ. Therefore, to produce the recombinant IL-36γ we used a modified IL36G gene encoding the processed IL-36γ form starting from Ser-18. However, the biological activity of such recombinant IL-36γ did not correspond to data presented in literature. We hypothesized that the IL-36γ biological activity is also lowered due to insufficient N-terminal methionine residue cleavage. For N-terminal methionine residue cleavage from both IL-36RA and IL-36γ we used 2 different strategies. First, the exogenous processing of proteins by recombinant methionine aminopeptidase (MAP). Second, the coexpression of the gene of the interest with the E. coli methionine aminopeptidase (map) gene under control of various promoters. In case of IL-36Ra the fully biologically active protein with cleaved methionine was obtained using both strategies. The optimal methionine-free IL-36Ra producer strain IL-36RA-MAP-BAD was created. The obtained preparations analysis by the methods of ELISA, RP-HPLC and biological test. The experiment with IL-36γ is not yet completed. It requires an additional analysis by mass spectrometry.