Molecular and genetic characteristics of influenza-vectored vaccine strain expressing protective proteins from different phases of Mycobacterium tuberculosis life cycle

Abstract

Несмотря на существующие успехи в борьбе с туберкулёзом, проблема остается актуальной уже более века. Эффективность единственной противотуберкулезной вакцины БЦЖ вызывает вопросы и сомнения, а потому актуальной является разработка новых противотуберкулёзных вакцин, направленных на предотвращение развития открытых форм заболевания и реактивации латентных очагов эндогенной инфекции. Одним из перспективных подходов создания защиты против туберкулёза является разработка мукозальной вакцины на основе гриппозного вектора, экспрессирующего белки различных фаз жизненного цикла M. tuberculosis. Интраназальная иммунизация вирусным вектором обеспечивает доставку антигенов M. tuberculosis в эпителиальные и антиген-презентирующие клетки респираторного тракта, что приводит к формированию системного противотуберкулезного иммунного ответа. Целью данной работы была характеристика гриппозного вектора с укороченным белком NS1, содержащего вставку туберкулезных антигенов TB10.4 и HspX. Нами был проведен анализ генетической стабильности вставки антигенов M. tuberculosis в гене NS вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX на протяжении последовательных пассажей в клетках Vero и куриных эмбрионах методом ОТ-ПЦР с электрофорезной детекцией. В процессе серии пассажей методом предельных разведений был получен генетически стабильный вариант, сохранявший полноразмерную вставку. Методом вестерн-блот с иммунодетекцией NS1-специфичными антителами была показана экспрессия химерного белка NS1-TB10.4-2A-HspX с теоретической молекулярной массой 45 кДа в клетках, зараженных пассажными вариантами вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX. По результатам масс-спектрометрического анализа в составе химерного белка были обнаружены пептиды, соответствующие NS1 (5 фрагментов), HspX (6 фрагментов) и TB10.4 (1 фрагмент). При интраназальном введении мышам C57/black/6 в дозе 6 lg ЭИД50/мышь вакцинный штамм обладал ограниченной способностью размножения в легких животных до титров 2,0 – 2,3 lg ЭИД50/мл, не вызывая при этом гибели животных и снижения массы тела, т.е. являлся аттенуированным по сравнению с исходным штаммом A/PR8/34. В результате выполненной работы получен генетически стабильный рекомбинантный штамм A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX, обеспечивающий экспрессию антигенов M. tuberculosis при заражении чувствительных клеток. Штамм безопасен для лабораторных животных и может быть использован в качестве вакцинного штамма-кандидата для получения векторной противотуберкулезной вакцины.

Despite the existing successes in the treatment of tuberculosis, the problem remains relevant for more than a century. The effectiveness of the only anti-tuberculosis vaccine BCG raises questions and doubts, and therefore it is important to develop new anti-tuberculosis vaccines aimed at preventing the development of open forms of the disease and reactivation of latent foci of endogenous infection. One of the promising approaches to creating protection against tuberculosis is the development of a mucosal vaccine based on the influenza vector expressing proteins of different phases of M. tuberculosis life cycle. Intranasal immunization with the viral vector ensures the delivery of M. tuberculosis antigens to the epithelial and antigen-presenting cells of the respiratory tract, which leads to the formation of a systemic antituberculous immune response. The purpose of this study was to characterize the influenza vector with a truncated NS1 protein containing an insert of tuberculosis antigens TB10.4 and HspX. We performed an analysis of the genetic stability of inserts in the M. tuberculosis antigen gene NS virus A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX during serial passages in Vero cells and chick embryos by RT-PCR with electrophoretic detection. In the process of the passage series by the method of limiting dilutions, a genetically stable variant was obtained, which retained the full-length insert. By western blot immunodetection with NS1-specific antibodies was demonstrated expression of the fusion protein NS1-TB10.4-2A-HspX with the theoretical molecular weight of 45 kDa in cells infected with passage variants of the virus A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX. Based on the results of mass spectrometric analysis, peptides corresponding to NS1 (5 fragments), HspX (6 fragments) and TB10.4 (1 fragment) were found in the chimeric protein composition. When intranasally administered to C57/black/6 mice at a dose of 6 lgEID50/mouse, the vaccine strain had a limited reproduction capacity in the lungs of animals to a titer of 2.0 - 2.3 lgEID50/ml, without causing animal death and weight loss, those was attenuated compared to the original strain A/PR8/34. As a result of the work performed, a genetically stable recombinant A / PR8 / NS124-TB10.4-2A-HspX strain was obtained, which ensures the expression of M. tuberculosis antigens upon infection of sensitive cells. The strain is safe for laboratory animals and can be used as a vaccine candidate strain for obtaining a vector antituberculous vaccine.