Active zone distribution in the Drosophila larval neuromuscular junction under human APP gene expression

Abstract

Данная работа направлена на дальнейшее изучение молекулярных механизмов, контролирующих высвобождение нейромедиатора. Белки, регулирующие везикулярный экзоцитоз, локализованы в пресинаптических активных зонах (АЗ), которые представляют собой молекулярную структуру регуляции синаптической передачи. Белок предшественник амилоида (АРР, amyloid precursor protein) является крупным трансмембранным белком, экспрессируемым в большинстве клеток животных. Хотя известно, что APP участвует в формировании синапсов и в регуляции синаптической и нейрональной функций, влияние APP на структурно-функциональную организацию АЗ ранее не изучалось. Для проверки данной возможности мы проанализировали влияние экспрессии гена APP человека на распределение АЗ в пресинаптических бутонах нервно-мышечного синапса Drosophila melanogaster. Эксперименты проводились на нервно-мышечных соединениях трансгенных линий личинок Drosophila melanogaster с разным уровнем APP человека. Для экспрессии генов человека в моторных нейронах личинки Drosophila использовали систему UAS-GAL4. В работе использовали иммуногистохимические методы и конфокальную микроскопию (Leica DMI6000). Анализ данных проводили с помощью программ Leica Application Suite X и Fiji. Анализировали нервные окончания, иннервирующие 6 и 7 мышечные волокна. Известно, что Bruchpilot (Brp) является ключевым скаффолд-белком АЗ у Drosophila, и мы идентифицировали АЗ по распределению этого белка. В линии с ко-экспрессией генов APP and β-secretase человека наблюдалось увеличение количества синаптических бутонов и общего количества АЗ в нервно-мышечном соединении. Однако среднее количество АЗ в индивидуальных бутонах, средняя площадь бутонов и плотность распределения АЗ в бутонах уменьшались. В линии Drosophila melanogaster с прямой экспрессией β-амилоида человека анализируемые параметры не отличались от контроля, что указывает на специфичность наблюдаемых эффектов для APP. Наши результаты позволяют предположить, что APP человека может участвовать в структурно-функциональной организации АЗ, реализуемой через изменение распределения Brp и вероятность квантовой секреции нейромедиатора.

This study provides further insight into the molecular mechanisms that control neurotransmitter release. Proteins that regulate vesicle exocytosis are localized at presynaptic active zones (AZs) that organize molecular machinery to regulate synaptic transmission. Amyloid precursor protein (APP) is a large transmembrane protein that is being expressed in major of animal cells. Although it is known that APP takes part in synapse formation and in the regulation of synaptic and neuronal function, the involvement of APP in control of structural and functional AZs organization was not previously studied. To test this possibility, we analyzed the effects of human APP gene expression on AZs distribution in presynaptic boutons of Drosophila melanogaster neuromuscular junctions. Experiments were performed on larval neuromuscular junctions of transgenic Drosophila melanogaster lines with different levels of human APP production. To express human genes in motor neurons of Drosophila, the UAS-GAL4 system was used. In this study, immunohistochemistry and confocal microscopy (Leica DMI6000) techniques were used. Data analysis was preformed using programs Leica Application Suite X and Fiji. Motor nerve endings of muscle fibers 6 and 7 were analyzed. Bruchpilot (Brp) is known to be the key scaffold protein of the AZ in Drosophila, and AZs were identified as Brp-positive puncta. Human APP and β-secretase genes co-expression increased the number of synaptic boutons and the total number of AZs per neuromuscular junction. However, the average number of AZs per bouton, average boutons area and distribution density of AZs in boutons were decreased. In Drosophila line with expression of human amyloid-β peptide itself, parameters analyzed did not differ from controls, suggesting the specificity of APP effects. Our results provide evidence to suggest that human APP can be involved in control of structural and functional organization of AZs via changes in Brp distribution as well as probability of quantal transmitter release.