Detection of Mycobacteria tuberculosis by morphological methods in patients with fibrocavernous pulmonary tuberculosis

Abstract

Тема НИР: «Выявление туберкулёзных микобактерий морфологическими методами при фиброзно-кавернозном туберкулёзе». Научный руководитель: проф. Д.м.н. Цинзерлинг Всеволод Александрович Исполнитель: аспирант очной формы обучения Агапов Михаил Михайлович АННОТАЦИЯ. Актуальность. По данным информационного бюллетеня ВОЗ за октябрь 2017 года, туберкулёзом в 2016 году в мире заболели 10,4 миллиона человек, умерли – 1,7 миллиона. Заболевание входит в число 10 наиболее распространённых причин смерти в мире. Туберкулёз наряду с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, ВИЧ-инфекцией и злокачественными новообразованиями выступает отдельным пунктом в утверждённой в 2014 году Государственной программе развития здравоохранения в Российской Федерации. Разумеется, задача улучшения ситуации с заболеваемостью и смертностью от туберкулёза в равной степени лежит как на лечебно-профилактическом, так и на диагностическом звеньях оказания медицинской помощи. В практике большинства стационаров, даже имеющих доступ к высокотехнологичным методам выявления микобактерий, морфологическая диагностика была, остаётся и будет одной из основных составляющих дифференциального диагноза очаговых и инфильтративных процессов в лёгких, внутригрудных лимфатических узлах и других локализаций. Цель исследования. Оптимизация выявления туберкулёзных микобактерий в тканях. Задачи исследования. 1) Подбор наиболее сложных для классического бактериоскопического выявления туберкулёзных микобактерий случаев, сопровождающихся многолетним течением заболевания с длительной безуспешной терапией. 2) Анализ отрицательных результатов окраски по Цилю-Нильсену при выраженности морфологических признаков туберкулёза (казеозный некроз, формирование гранулём с гигантскими клетками Лангганса) и наличии рентгенологических, микробиологических, иммунологических признаков туберкулёза. 3) Сравнение результатов гистохимического выявления микобактерий по Цилю-Нильсену, флюоресцентной окраски аурамином-родамином и иммуногистохимического метода. 4) Сбор данных о морфологических и тинкториальных свойствах туберкулёзных микобактерий необычной формы. Научная значимость. Расширить представления о микробиологических свойствах возбудителя, его жизненном цикле, структуре клеточной стенки, способности к образованию биоплёнки. Практическая значимость. Ранее не встречались попытки произвести подробный анализ случаев отрицательной или слабоположительной окраски по Цилю-Нильсену, т.к. причиной подобных явлений считались дефекты при окраске, взятии материала, его фиксации, обезвоживании, либо ошибки при приготовлении реактивов. Благодаря расширению знаний о тинкториальных свойствах туберкулёзных микобактерий появится возможность выработать алгоритм морфологической диагностики туберкулёза и избежать случаи гипо- и гипердиагностики заболевания. Материалы и методы. Было изучено 24 аутопсийных случая клинически, рентгенологически и микробиологически верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулёза лёгких. Большинство пациентов – мужчины, средний возраст 49,67±5,77 лет. У большей части пациентов была зафиксирована широкая (14 случаев ШЛУ МБТ) либо множественная (5 случаев МЛУ МБТ) лекарственная устойчивость (т.е. невосприимчивость заболевания, соответственно, к четырём или двум противотуберкулёзным препаратам первой линии), при этом ни в одном из случаев не имелось сочетания туберкулёза с ВИЧ. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах. Кусочки лёгких для гистологического исследования фиксировались в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах и заливкой в парафин по общепринятым методикам. Срезы окрашивались гематоксилином-эозином, карболовым фуксином по Ц-Н, аурамином-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), так же производилось иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к антигену РАВ (Protein antigen B). Исследование включало в себя оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулёзного процесса, подсчёт количества микобактерий при увеличении х400 и количества полей зрения, в которых они визуализируются, соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными и прочими), а так же их локализации (внутриклеточно, внеклеточно, либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов). После оценки процентного соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывалось среднее значение для каждой формы, затем вычислялась абсолютная погрешность с доверительной вероятностью γ=0,95. Значимость различий между методами исследования оценивалась путём вычисления критерия Стьюдента и сравнения с критическими значениями. Результаты. Во всех наблюдениях выявлены характерные для прогрессирующего туберкулёза изменения. При окраске по Цилю-Нильсену обнаруживались единичные скопления кислотоустойчивых бактерий (менее чем в 10 полях зрения общим числом не более 1000). При окраске аурамином-родамином число обнаруженных микобактерий оказалось достоверно выше (в 10-50 полях зрения, общим числом от 1000 до 10000), а наибольшим оно было при ИГХ-исследовании (более чем в 50 полях зрения общим числом свыше 10000). При этом локализация микобактерий при всех видах исследования была исключительно внеклеточной. Доля типичных палочек при окраске по Цилю-Нильсену (85-95%, в среднем 88,13±2,14) значимо больше таковой, выявленной при окраске аурамином-родамином (50-85%, в среднем 64,38±4,24) и ещё более значимо больше, чем при проведении ИГХ (50-70%, в среднем 57,29±2,78). Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявляемых при окраске по Цилю-Нильсену в минимальном количестве, и обнаруживаемых в большом количестве при флюоресцентном исследовании и ИГХ-исследовании. Выводы. 1. Во всех исследованных случаях диагноз туберкулёз не вызывал никаких сомнений и, несмотря на значительные различия индивидуальных особенностей пациентов, морфологическая картина во всех без исключения случаях имела поразительное сходство. 2. Проведённое исследование подтвердило, что туберкулёзные микобактерии могут выявляться в тканях с помощью различных методов и иметь различную морфологию, при этом наличие даже небольшого числа кислотоустойчивых бактерий при окраске по Ц-Н является важным диагностическим признаком, но их отсутствие не свидетельствует об отсутствии туберкулёза. 3. При использовании всех бактериоскопических методов на светооптическом уровне на нашем материале внутриклеточных форм возбудителя не обнаружено. 4. Наибольшая доля атипичных морфологических форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (35,62%) и иммуногистохимическом (42,71%) исследованиях, что демонстрирует их более высокую чувствительность, в то время как при окраске по Ц-Н атипичные микобактерии выявляются в сравнительно небольшом количестве (11,87%). 5. Микобактерии однозначно обладают различной вирулентностью, которая не связана с видовой принадлежностью, а имеет, наиболее вероятно, генетические основы. 6. Микробиологическая сущность и клиническое значение морфологического полиморфизма микобактерий требуют дальнейшего изучения. Более того, можно утверждать, что в уточнении нуждается и патогенез туберкулёза в целом.

Research topic: «Detection of Mycobacteria tuberculosis by morphological methods in patients with fibrocavernous pulmonary tuberculosis». Research advisor: professor Zinserling Vsevolod Aleksandrovich Author: postgraduate student Agapov Mikhail Mikhailovich SUMMARY. Actuality. According to the WHO information Bulletin in October 2017, in 2016 there were an estimated 10.4 million new (incident) cases of tuberculosis worldwide, 1.7 million people died from tuberculosis. The disease is among the 10 most common causes of death in the world. Tuberculosis, along with the cardiovascular diseases, HIV and malignant neoplasms, is a separate item in the State program for the development of health care in the Russian Federation approved in 2014. Obviously, the task of improving the situation with the incidence and mortality from tuberculosis is equally on the therapeutic, preventive, and diagnostic links of medical care. In the practice of the majority of hospitals, even with access to high-tech methods of Mycobacterium detection, morphological diagnosis was, remains and will be one of the main components of the differential diagnosis of focal and infiltrative processes in the lungs, intrathoracic lymph nodes and other localizations. Study objective. Optimization of detection of tuberculous mycobacteria in tissue. Study tasks. 1) Selection of the cases, most difficult for the classical bacterioscopic detection of tuberculosis mycobacteria, accompanied by a long-term course of the disease with long-term unsuccessful therapy. 2) Analysis of the negative results of Ziehl-Neelsen staining in combination with simultaneous marked morphological signs of tuberculosis (caseous necrosis, formation of granulomas with giant Langhans cells) and the presence of radiological, microbiological, and immunological characteristics of tuberculosis. 3) Comparison of the results of histochemical detection of mycobacteria by Ziehl-Neelsen, fluorescent staining by auramine-rhodamine and immunohistochemical method. 4) Accumulation of data on morphological and tinctorial features of atipical forms of tuberculosis mycobacteria. Scientific significance. To expand the understanding of the microbiological features of the pathogen, its life cycle, the structure of the cell wall, the ability to form a biofilm. Practical significance. There is no previous attempts to produce a detailed analysis of the cases of negative or poorly positive staining by Ziehl-Neelsen, because the cause of these phenomena was considered to be defects in staining, taking of the specimen, its fixation, dehydration or mistakes in the preparation of reagents. Through the expansion of knowledge about the tinctorial features of tuberculosis mycobacteria will be able to develop an algorithm for morphological diagnosis of tuberculosis and to avoid cases of hypo- and hyperdiagnosis. Materials and methods. 24 autopsy cases of clinically, radiologically and microbiologically verified fibrocavernous pulmonary tuberculosis were studied. The majority of patients were male, mean age 49.67±5.77 years. The majority of patients had a broad (14 cases) or multiple (5 cases) drug resistance (i.e., the disease's resistance, respectively, to four or two first-line anti-tuberculosis drugs), and in none of the cases there was a combination of tuberculosis with HIV. In all cases, there was a long-term course of the disease and prolonged treatment in specialized hospitals. Lungs specimens for histological examination were fixed in 10% neutral formalin with subsequent processing in alcohols and paraffin embedding according to conventional methods. The sections were stained with hematoxilin-eosin, carbolic fuchsin by Ziehl-Neelsen, auramin-rhodamine (with subsequent research using a luminescent microscope), also perform immunohistochemical study using monoclonal antibodies to the Protein antigen B. The study included an assessment of the severity of morphological changes in the area of caverns and the activity of the tuberculous process, counting the number of mycobacteria with an magnification X400 and the number of fields of vision in which they are visualized, the ratio between different morphological forms of the pathogen (rod-shaped, coccoid and others), as well as their localization (intracellular, extracellular, or adhesion on the surface of phagocytes). After evaluating the percentage of different morphological forms of mycobacteria, the average value for each form was calculated, then the absolute error with confidence probability γ=0.95 was calculated. The significance of the differences between the methods was assessed by calculating the Student criterion and comparing it with the critical values. Results. When stained with hematoxylin-eosin in all cases was revealed specific pattern of tuberculosis, corresponding to progression of the infection process. When stained by Ziehl-Neelsen isolated clusters of acid-fast bacilli (less than 10 fields of view a total of not more than 1000) were demonstrated. When stained with auramine-rhodamine number of detected mycobacteria was significantly higher (10-50 fields of view, the total number from 1000 to 10000), and the highest it has been in IHC examination (more than 50 fields of view a total of more than 10000). The localization of mycobacteria in all methods were exclusively extracellular. The part of the typical rods when stained acc. Ziehl-Neelsen (85-95%, on average 88,13±2,14) significantly more than that identified when stained with auramine-rhodamine (50-85%, the average 64,38±4,24) and even more significantly more than in the IHC (50-70%, on average 57,29±2,78). As much different parameters for atypical morphological forms of mycobacteria to be detected when stained by Ziehl-Neelsen at the minimum number, and are found in large quantity in the study of fluorescence and IHC examination. Conclusion. 1. In all the cases studied, the diagnosis of tuberculosis did not cause any doubts and, despite the significant differences in the individual features of patients, the morphological picture in all cases without exception had a striking similarity. 2. The study confirmed that tuberculosis mycobacteria can be detected in tissues by different methods and have different morphology, with the presence of even a small number of acid-resistant bacteria when stained by Ziehl-Neelsen is an important diagnostic feature, but their absence does not indicate the absence of tuberculosis. 3. When using all bacterioscopic methods at the light-optical level, no intracellular forms of the pathogen were detected in our material. 4. The highest proportion of atypical morphological forms of mycobacteria is found in fluorescent (35.62%) and immunohistochemical (42.71%) studies, which demonstrates their higher sensitivity, while when stained by Ziehl-Neelsen atypical mycobacteria are detected in a relatively small amount (11.87%). 5. Mycobacteria clearly have different virulence, which is not related to species, and has, most likely, genetic basis. 6. The microbiological nature and clinical significance of the morphological polymorphism of mycobacteria require further study. Moreover, it can be argued that the pathogenesis of tuberculosis in General needs clarification.