A study of the aggregation status of the RRM2 domain of TDP-43 protein under oxidative stress by NMR diffusion measurements

Abstract

Окислительный стресс обычно приводит к повреждению клеточных молекулярых механизмов. Белки, имеющие экспонированные в растворитель боковые цепи цистеинов, подвергаются сшиванию дисульфидными связями. Этот процесс подразумевает (i) дестабилизацию структуры белка, в следствии случайных взаимодействий поверхностных аминокислотных остатков, происходящих на белок-белковых интерфейсах и (ii) образование агрегатных частиц, содержащих несколько мономерных единиц белка. Эти последствия были изучены на примере домена RRM2 белка TDP-43. Состояние агрегации 15N меченого RRM2 в условиях окислительного стресса было определено с помощью PFGSTE ЯМР диффузометрии. Записанные спектры были обработаны с помощью специально разработанного Матлаб тулбокса “2D NMR spectra fitter”. Молекулярная масса и гидродинамические свойства диффундирующих частиц, рассчитанные по значениям коэффициентов диффузии, показали, что в восстановительных условиях RRM2 является мономером, а обработка оксидантами приводит к образованию агрегатных частиц, содержащих более 10 единиц RRM2. Исследования температурной денатурации, наблюдаемой с помощью протонного ЯМР, показали уменьшение характерной температуры разворачивания RRM2 для окисленного образца по сравнению с контрольным. Сдвиг температуры денатурации говорит о том, что окислительный стресс оказывает дестабилизирующее влияние на структурную стабильность RRM2. Общая картина подтверждает механизм образования сшитых дисульфидными связями телец-включений TDP-43, которые требуют в качестве затравки С-концевые фрагменты TDP-43, продуцируемых протеолитическим расщеплением внутри развернутого RRM2.

The oxidative stress usually results in damage of cellular molecular machinery. Proteins with solvent-exposed cysteine side chains undergo disulfide cross-linking. This process implies (i) destabilization of protein structure produced by random pairing of surface residues as occurs at the protein-protein interfaces and (ii) formation of aggregate particles comprising several monomer units of proteins. These consequences were studied using the case of RRM2 domain of TDP-43 protein. The aggregation status of 15N-labeled RRM2 under the conditions of oxidative stress was determined by PFGSTE NMR diffusion measurements. The recorded spectra were analyzed by specially developed Matlab toolbox “2D NMR spectra fitter”. The molecular mass and the hydrodynamic properties of the diffusing particles calculated using the obtained values of diffusion coefficients showed that under reducing conditions the RRM2 is monomer, while treatment by oxidants causes the formation of aggregate particles comprising more than 10 units of RRM2. Temperature denaturation studies monitored by proton NMR have revealed the decrease of characteristic temperature of RRM2 unfolding for oxidized sample in comparison to control one. The shift in denaturation temperature indicated that oxidative stress has a destabilizing impact on the structural stability of RRM2. The emerging picture supports the mechanism of formation of disulfide cross-linked TDP-43 inclusion bodies, which require as a seed the C-terminal fragments of TDP-43 produced by proteolytic cleavage within unfolded RRM2.