Investigation of the role of proteasomes in the appearance of the truncated form of alpha-tubulin in the human cells

Abstract

26S протеасома – мультисубъединичный белковый комплекс, отвечающий за избирательную деградацию белков в клетке. Существует ряд белков с известными и неизвестными функциями, которые постоянно или краткосрочно связываются с 26S протеасомами. Определение белков, взаимодействующих с протеасомами, является одним из важных этапов в понимании функций протеасом в клетке и механизмов их регуляции. На примере клеток миелогенной лейкимии человека линии К562 мы показали с помощью MALDI-ICR-масс-спектрометрии, что с аффинно-очищенными протеасомами ассоциированы белки убиквитин-протеасомной системы, теплового шока, участники метаболизма, а так же некоторые белки цитоскелета, такие как актин, альфа-актинин 4, альфа- и бета-тубулины. Вестерн-блот-анализ показал, что с очищенными из клеток К562 протеасомами ассоциируется укороченная изоформа альфа-тубулина. Присутствие изоформы альфа-тубулина в комплексе с аффинно-очищенными протеасомами также обнаружено в человеческих клетках линии HEK293. Известны несколько генов альфа- и бета-тубулинов, все они высоко консервативны как между собой, так и между видами. Для многих белков семейства альфа-тубулинов (48-49 кДа) показано существование различных изоформ – результат альтернативного сплайсинга. В литературе встречаются данные о процессинге белка в протеасомах, и, наблюдаемая укороченная изоформа альфа-тубулина может быть результатом процессинга протеасомами. Для проверки данной гипотезы созданы генетические конструкции, кодирующие альфа-тубулин человека, меченный по С- или N-концу полигистидиновой последовательностью, для экспресси в E.coli и подобраны условия очистки рекомбинатного белка с использованием взаимодействия полигистидиновой метки с Ni2+. В результате реакции протеолиза альфа-тубулина протеасомой установлено, что в системе in vitro экспрессированный в E.coli альфа-тубулин человека не подвергается процессингу и расщеплению протеасомой убиквитин-независимо.

The 26S proteasome is a multisubunit protein complex responsible for selective protein degradation in the cell. A number of proteins with known and unknown functions were shown to be permanently or temporarily associated with 26S proteasomes. Identification of proteins that interact with proteasomes is an important step in the understanding of the proteasome functions in the cell and the mechanisms of their regulation. Using MALDI–ICR mass spectrometry, we have shown that some proteins of the ubiquitin-proteasome system, heat-shock proteins, proteins involved in metabolism and some cytoskeleton proteins, such as actin, alpha-actinin 4, and alpha- and beta-tubulins are associated with proteasomes obtained by affinity purification from the human myelogenous leukemia cell line K562. Western blot analysis showed that a truncated form of alpha-tubulin was associated with the purified proteasomes. The presence of the alpha-tubulin isoform in complex with affinity purified proteasomes was also observed in the human embryonic kidney cell line 293. There exist several alpha- and beta-tubulin genes, which are strongly conserved both within and among species. Many proteins of the alpha-tubulin family (48–49 kDa) have been shown to possess several isoforms produced by alternative splicing. It is known that some proteins are processed by proteasomes therefore the observed truncated isoform of alpha-tubulin might be the result of processing by proteasomes. To test this hypothesis, genetic constructs encoding human alpha-tubulin, labeled at the C or N-terminus with a polyhistidine sequence, for the expression in E. coli, were constructed and conditions for purifying the recombinant protein using the interaction of the polyhistidine tag with Ni2 + were optimized. As a result of the reaction of proteolysis of alpha-tubulin by the proteasome, it has been established that in an in vitro system, the human alpha-tubulin expressed in E.coli is not subjected to processing and cleavage by the proteasome without ubiquitin.