Genetic mechanisms of suppression of mutations in genes controlling the dark chlorophyll biosynthesis in the green alga Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

У зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii мутация brs-1 в гене CHLH, кодирующем большую субъединицу магний-хелатазы, блокируют биосинтез хлорофилла. Бесхлорофильные клетки мутантов по этому гену светочувствительны и в темноте формируют оранжевые колонии. В результате УФ-мутагенеза в культуре мутанта brs-1 по гену CHLH был отобран светоустойчивых ревертант R6-brs, синтезирующий хлорофилл в темноте и на свету, который стал предметом исследований механизмов, восстанавливающих биосинтез хлорофилла в условиях нарушения функций магний-хелатазы. Изучены фенотипические особенности клеток ревертанта R6-brs. При выращивании на свету, клетки R6-brs формируют мелкие колонии, и для их роста необходим дрожжевой экстракт. Время деления клеток R6-brs втрое превышает показатели, характерные для штамма дикого типа 137С. Объем клеток ревертанта в 4.5 раза больше объема клеток дикого типа. Транскрипция генов биосинтеза хлорофилла в темноте у ревертанта скоординирована. При световой индукции в его клетках усиливается экспрессия генов HEMA и CHLI2. При постоянном освещении транскрипция гена CHLH в клетках R6-brs превышена в 8 раз по сравнению с диким типом, остальные гены экспрессируются слабее. Причиной фенотипических особенностей ревертанта может быть избыточное содержание в его клетках эндогенных цитокининов. Анализ экспрессии генов биосинтеза цитокининов показал, что на свету в клетках ревертанта их экспрессии снижена, по-видимому, за счет ингибирования эндогенными цитокининами. Таким образом, в результате супрессорной мутации у ревертанта R6-brs был восстановлен биосинтез хлорофилла, при этом нарушилась сложная регуляция многоступенчатого процесса синтеза тетрапирролов, что привело к серьезным изменениям на фенотипическом уровне, затрагивающим процессы деления клеток.

In the green alga Chlamydomonas reinhardtii, the brs-1 mutation in CHLH gene, which encodes a large subunit of magnesium-chelatase, blocks the biosynthesis of chlorophyll. The brs-1 mutant are absent of chlorophyll, photosensitive and form orange colonies in the dark. As a result of UV mutagenesis in the culture of brs-1 mutant was isolated light-resistant R6-brs revertant, capable of synthesizing chlorophyll both in the dark and light. This revertant was the subject of studies, connected with the mechanisms, restoring chlorophyll biosynthesis under conditions of magnesium-chelatase function disruption. Phenotypic characteristics of the R6-brs revertant cells have been studied. When grown in the light, R6-brs cells form small colonies and require the yeast extract. The division of R6-brs cells takes three times longer than of the 137C wild-type strain cells. The cellular volume of R6-brs revertant is 4.5 fold bigger than the volume of wild-type cells. The transcription of chlorophyll biosynthesis genes in the revertant cells is coordinated in the dark. Upon light induction the expression of HEMA and CHLI2 genes is enhanced in R6-brs cells. Under constant light, transcription of CHLH gene in R6-brs cells is 8 fold higher than in the wild type cells, while the rest of the genes are less expressed. An excessive content of endogenous cytokinins can be the cause of the phenotypic characteristics of the revertant cells. Gene expression analysis of cytokinin biosynthesis genes has shown that their expression is reduced in the R6-brs in the light, apparently because of inhibition by endogenous cytokinins. Thus, as a result of the suppressor mutation in the R6-brs cell the chlorophyll biosynthesis was restored, but the complex regulation of the multi-step process of tetrapyrrole synthesis was violated, what led to serious changes at the phenotypic level affecting the processes of cell division.