Role of post-translational modifications of proteasome proteins in extracellular proteasome transport

Abstract

26S-протеасома – эукариотический мультисубъединичный белковый комплекс, осуществляющий регулируемую убиквитин-зависимую деградацию белков. Кроме протеасом, присутствующих в ядре и цитоплазме клетки, также было показано наличие протеасом и в межклеточном пространстве. Функции внеклеточных протеасом неизвестны, однако был выявлен повышенный уровень экспорта протеасом во внеклеточное пространство при опухолевой трансформации клеток. Анализ внеклеточных протеасом по присутствию специфических посттрансляционных модификаций и их функциональной значимости в экспорте протеасом не проводился. В связи с этим, целью настоящей работы явился поиск специфических для внеклеточных протеасом посттрансляционных модификаций. По результатам MС-анализа фосфорилирование по серину в 181-м положении в субъединице β3 (PSMB3) протеасомы человека нами обнаружено впервые и является кандидатом на внесение в список посттрансляционных модификаций, специфических для внеклеточных протеасом. Наряду с данной посттрансляционной модификацией также впервые были обнаружены 36 посттрансляционных модификаций у клеточных, и 20 - у внеклеточных протеасом. Получены и апробированы плазмидные конструкции pX330 системы CRISPR/Cas9, нацеленных на второй и третий экзоны гена субъединицы β3 (PSMB3) протеасомы с целью дальнейшего нокаута по гену PSMB3 доксициклин-регулируемых клеточных линий. Также получена линия клеток K562, стабильно экспрессирующая генетическую конструкцию, кодирующую субъединицу протеасом β3 (PSMB3) слитую на N-конце с последовательностью T7, с целью дальнейшего получения линий клеток HeLa, стабильно экспрессирующих нормальную и, созданную нами, мутантную последовательности.

26S-proteasome is a multisubunit eukaryotic protein complex, which degrades proteins in a regulated ubiquitin-dependent manner. In addition to the proteasomes present in the nucleus and cytoplasm of the cell, the presence of proteasomes in the extracellular space was also shown. The functions of extracellular proteasomes are unknown, however, an increased level of proteasome export into the extracellular space was revealed during tumor cell transformation. Analysis of extracellular proteasomes by the presence of specific post-translational modifications and their functional significance in the export of proteasomes was not carried out. In connection with this, the purpose of this work was the search for post-translational modifications specific for extracellular proteasomes. According to the results of MS analysis, serine phosphorylation in the 181th position in the human proteasome β3-subunit (PSMB3) was first discovered by us and considered as a post-translational modification potentially specific for extracellular proteasomes. Along with this post-translational modification, 36 posttranslational modifications were also found for the first time in cellular, and 20 - for extracellular proteasomes. pX330 plasmid constructs of the CRISPR/Cas9 system targeting the second and third exons of the β3 (PSMB3) proteasome subunit gene were obtained and tested for further knockout of the PSMB3 gene of the doxycycline-regulated cell lines. Also, K562 cell line stably expressing the genetic construct coding for the β3 proteasome subunit (PSMB3) fused at the N-terminus with the T7 sequence was developed to further generate HeLa cell lines stably expressing the normal and mutant sequence we created.