Genotyping of influenza virus by high resolution method of the PCR products melting curves analysis (HRM-analysis)

Abstract

Высокая изменчивость вирусов гриппа вызывает необходимость ежегодного обновления штаммового состава гриппозных вакцин. На промежуточных этапах подготовки вакцинного штамма, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов (провести первичный скрининг), возникает потребность в разработке новейших быстрых и недорогих методов первичного скрининга. Данная работа посвящена разработке эффективной и экономичной методики генотипирования реассортантных вирусов гриппа- ПЦР в реальном времени с последующим анализом кривых плавления высокого разрешения (high resolution melting, HRM-анализ) при использовании интеркалирующего флуоресцентного красителя EvaGreen. Молекулярно-генетический метод HRM (high resolution melting curve analysis) основан на проведении амплификации фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. В отличие от других молекулярно-генетических методов HRM-анализ позволяет выявлять мутации в интересующих фрагментах генов в процессе одной реакции, позволяет определять однонуклеотидные замещения, не имеет контаминационной опасности.

High variability of influenza viruses makes it necessary to update strains of influenza vaccines annually. In the intermediate stages of designing a vaccine strain, when it is necessary to quickly analyze a significant number of reassortants (to conduct primary screening), a need to develop the newest quick and reasonable methods of primary screening arises. This research focuses on developing a cost-effective method of genotyping of reassortant influenza viruses - real-time PCR followed by an analysis of the high resolution melting curves (high resolution melting, HRM analysis) with the use of an intercalating fluorescent dye EvaGreen. The molecular genetic HRM method (high resolution melting curve analysis) is based on implementation of amplification of DNA fragments with subsequent analysis of their high resolution melting curves. The presented method shows high sensitivity and specificity. Unlike other molecular genetic methods, HRM analysis makes it possible to detect all mutations in the targeted fragments of genes during one reaction and to detect single-nucleotide replacements. The method does not have any contamination hazard.