The intratumour morphologic and molecular heterogeneity in astrocytomas of varying degrees of malignancy

Abstract

Введение. Астроцитарные новообразования составляют более 50% от всех нейроэпителиальных опухолей. Несмотря на современные успехи онкологии, показатели 5-летней продолжительности жизни пациентов с данным видом опухолей остаются по-прежнему невысокими: с диффузной астроцитомой (ДА) – 50,1%, с анапластической астроцитомой (АА) – 29,8%, а с первичной глиобластомой (ГБ) – всего 5,5%. Это связано с высокой частотой рецидивирования данных опухолей и приобретением резистентности к проводимой терапии. Одна из возможных причин этого - внутриопухолевая гетерогенность, проявляющаяся на морфологическом и молекулярно-генетическом уровнях. Цель работы. Определить наличие морфологической и молекулярно-генетической гетерогенности в первичной глиобластоме, анапластической астроцитоме и диффузной астроцитоме. Материалы и методы. Было проведено проспективное исследование 22 больных в возрасте 18 лет и старше с впервые диагностированной супратенториальной нейроэпителиальной опухолью. Всем пациентам было проведено хирургическое удаление первичной опухоли с интраоперационным забором фрагментов опухолевой ткани из 5 равноудаленных точек. Выполнена гистологическая верификация материала + иммуногистохимическое исследование (ИГХ) c использованием антител GFAP (poly, DakoCytomation) и Ki-67 (MIB-1, DakoCytomation), а при необходимости: Syn (27G12, DakoCytomation), NB (NB84A, Leica), CD99 (12E7, DakoCytomation). В части случаев была определена относительная экспрессия мРНК генов ERCC1, TOP2A, MGMT, VEGF, C-kit, PDGFR- при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Мутации в генах IDH1 (экзон 4) и IDH2 (экзон 4) в опухолевой ткани выявлялась при помощи анализа кривых плавления ПЦР-продуктов с высоким разрешением (HRMA – High Resolution Melting Analysis) с последующим секвенированием ДНК. Результаты. Внутриопухолевая морфологическая гетерогенность была изучена у 22 больных (110 парафиновых блоков) и присутствовала в 68,8% (11/16), в АА – в 80% (4/5) и в единственном случае ДА. Ровно в половине случаев опухоль была гетерогенна в трех и более фрагментах из пяти (50%). Внутриопухолевая молекулярно-генетическая гетерогенность была изучена в 8 случаях (2 случая – АА и 6 – ГБ). Всего проанализировали 33 фрагмента опухолевой ткани (по 5 фрагментов из каждого опухолевого узла, из них в 7 не удалось выделить достаточное количество РНК для проведения анализа). Изменение уровней экспрессии шести генов (ERCC1, TOP2A, MGMT, VEGF, C-kit, PDGFR-) изучено в 48 экспрессионных анализах. Уровни экспрессии мРНК генов PDGFR-α, VEGF, TOP2A, MGMT в разных фрагментах одной опухоли различались в 4 из 8 случаев (50%), в гене C-kit – в 3 из 8 (37,5%), в гене ERCC1 – 1 из 8 (12,5%). Таким образом, уровни экспрессии мРНК всех изучаемых генов отличались в 41,7% (20/48) и оставались неизменёнными в 58,3% случаев. Молекулярно-генетическая гетерогенность при определении мутации в генах IDH1/2 отсутствовала. Морфологическая гетерогенность отличается большей частотой, чем молекулярно-генетическая (72,7% и 41,7% соответственно). Выводы. Для астроцитарных новообразований характерна морфологическая и молекулярно-генетическая внутриопухолевая гетерогенность. Морфологическая внутриопухолевая гетерогенность была выявлена у пациентов с диффузной астроцитомой, анапластической астроцитомой и первичной глиобластомой в 72,7% случаев – в 68,8% ГБ (11/16), в АА – в 80% (4/5) и в единственном случае ДА. Экспрессия мРНК генов MGMT, ERCC1, PDGFR-α, VEGF, TOP2A, C-kit отличалась в разных фрагментах опухолевой ткани в 41,7% случаев. Молекулярно-генетическая гетерогенность при определении мутаций в генах IDH1/2 не выявлена. Наличие внутриопухолевой гетерогенности осложняет постановку правильного диагноза и выбор тактики лечения в случае малого количества материала, предоставленного морфологам для исследования. Учитывая данный факт, необходимо во время оперативного вмешательства осуществлять забор не менее трёх фрагментов опухолевой ткани.

Introduction. Intratumor heterogeneity is one of the key reasons for unfavourable prognosis in malignant tumors. Astrocytic tumors are known to develop therapy resistance inevitably during the course of disease. One of possible reason is tumor heterogeneity. Purpose. The aim of this work was to assess the intratumor morphologic and molecular heterogeneity in diffuse astrocytoma, anaplastic astrocytomas and primary glioblastomas. Materials and methods. We conducted morphologic (22 cases) and molecular-genetic (8 cases) analysis of surgical specimens obtained from primarily operated glioblastoma GIV (GB), anaplastic astrocytomas GIII (AA) and diffuse astrocytoma GII (DA) patients aged 18 years and older in whom total or subtotal tumor resection was performed. Tissue sampling for the analysis was performed from 5 equidistant areas of each tumor. Morphologic diagnosis was established according to WHO classification of central nervous system tumors (2007/2016). MGMT, C-kit, TOP2A, PDGFR-α, ERCC1, VEGF genes mRNA expression was assessed by RT-PCR. IDH1/IDH2 mutational status was evaluated by allele-specific PCR. Results. Morphologic heterogeneity was evident in 72,7% tumors (16/22) overall. Heterogeneity was observed in 68,8% (11/16) of GB, 80% (4/5) of AA and in the only case of DA. In 50% of cases at least 3 different morphologic variants were seen in different areas of the tumor. This morphologic heterogeneity presented as the combination of different grades of anaplasia (GII – GIV) in one tumor. Molecular profile was assessed in 48 expression analysis of genes: MGMT, C-kit, TOP2A, PDGFR-α, ERCC1, VEGF from 8 patients. Intratumoral molecular heterogeneity was revealed in 41,7% of cases (20/48). Conclusion. Astrocytic tumors are characterized by the presence of morphological and molecular genetic intratumoral heterogeneity. The presence of intratumoral heterogeneity should be taken into account during surgery for adequate tumor sampling for histologic and molecular analysis which is critical for proper assessment of prognosis and following treatment planning.